Receptores Que Expresan Los Linfocitos B?

Receptores Que Expresan Los Linfocitos B
Ontogenia linfocitaria y generación del BCR y TCR

ISSN 1666-7948 www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar

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  • Ontogenia B: el delicado equilibrio entre la diversidad y la autoinmunidad
  • Romina Gamberale*
  • Laboratorio de Inmunología, IIHema, Academia Nacional de Medicina
  • Recibido 10 de agosto de 2004
  • Aceptado 29 de agosto de 2004
  • Resumen
  • Los linfocitos B, al igual que el resto de las células del sistema inmune, se originan en médula ósea a partir de un precursor común. Las células B comienzan su maduración en la médula ósea y la finalizan en el bazo. Durante las primeras etapas de desarrollo, los esfuerzos se centran en la generación de la inmunoglobulina de superficie que es parte del receptor B (BCR).

    1. Palabras clave: linfocitos B, ontogenia
    2. Ontogeny of B lymphocytes: The subtle balance between diversity and autoimmunity”
    3. Abstract
    4. Introducción

    Los seres humanos nos encontramos expuestos continuamente a una gran cantidad de microorganismos potencialmente patógenos, sin embargo, sólo nos enfermamos en forma ocasional. Esto es así gracias a nuestro sistema inmune, el cual constituye un sistema muy eficiente de defensa contra la infección.

    Distintos tipos de células sanguíneas tales como, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos/macrófagos, linfocitos T y linfocitos B, participan en la respuesta inmunológica. La estrategia de defensa contra la infección involucra distintas etapas : una etapa temprana, conocida con el nombre de inmunidad innata, y una etapa tardía denominada inmunidad adaptativa.

    Los linfocitos B y T son los principales protagonistas de la respuesta inmune adaptativa y, a diferencia del resto de las células del sistema inmune, poseen en su membrana receptores antigénicos capaces de reconocer en forma específica pequeñas porciones del patógeno (para el caso de los linfocitos B) o células infectadas con los mismos (en el caso de los linfocitos T).

    Luego de este reconocimiento, pueden activarse, multiplicarse y diferenciarse en células efectoras capaces de defendernos contra ese microorganismo en particular. La estrategia utilizada en la inmunidad adaptativa para reconocer a la gran cantidad de microorganismos existentes, involucra a una inmensa variedad de linfocitos B y T, cada uno de los cuales porta en su superficie un receptor particular para el antígeno.

    Gracias a esta gran diversidad de receptores antigénicos, un individuo tiene la capacidad de desarrollar una respuesta inmune adaptativa contra la amplísima variedad de patógenos con los que puede encontrarse durante su vida.

    • En este artículo, veremos:
    • v Las características del receptor antigénico de los linfocitos B.
    • v Las etapas de maduración de los linfocitos B durante su desarrollo.
    • v Cómo es posible generar la gran diversidad de receptores antigénicos existentes.
    • ¿Cómo es el receptor antigénico de los linfocitos B?

    El receptor antigénico de los linfocitos B se denomina BCR ( B cell receptor ) y está constituido por una inmunoglobulina (Ig) asociada con un heterodímero formado por las moléculas Ig a e Ig b ( Figura 1). La Ig que forma parte del BCR no es otra cosa que una molécula de anticuerpo anclada a la membrana.

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    Figura 1: El BCR está constituido por una inmunoglobulina (Ig) de superficie y el heterodímero Ig a -Ig b, La Ig esta constituida por dos cadenas pesadas (H) idénticas entre si, asociadas por puentes disulfuro y dos cadenas livianas (L) idénticas entre si, asociadas a las H por puentes disulfuro.

    Comparando un gran número de Ig, se observó que la porción amino-terminal de ambas cadenas es variable (V) y está involucrada en el reconocimiento del antígeno. Por el contrario, la porción carboxi-terminal de ambas cadenas es relativamente constante (C). En la figura se observan las cadenas H en color verde, las cadenas L en color amarillo y los dominios variables rayados.

    ¿Qué función cumplen los linfocitos B? Aquellos linfocitos B que reconocen al antígeno específico a través del BCR, pueden activarse y proliferar originando un clon de células hijas, para diferenciarse posteriormente a plasmocitos ( Figura 2 ). Estos últimos tienen la capacidad de secretar moléculas de Ig (anticuerpos), los cuales poseen la misma especificidad de la Ig que formaba parte inicialmente del BCR.

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    Figura 2 Las distintas porciones constantes de la cadena pesada (CH) dan origen a los diferentes tipos de anticuerpos conocidos (IgM, IgG, IgE, IgA e IgD), y cada una de estas clases de Ig es particularmente eficiente en la activación de los distintos mecanismos efectores.

    Sin embargo, la Ig que forma parte del BCR no lleva a cabo esas funciones ya que se encuentra anclada en la membrana de la célula B, por lo tanto, solamente es capaz de reconocer al antígeno específico a través de la región variable. ONTOGENIA de LINFOCITOS B ¿Dónde se originan los linfocitos B? Los linfocitos B, al igual que el resto de las células del sistema inmune, se originan en la médula ósea a partir de un precursor común, denominado stem cell o célula madre pluripotente hematopoyética (CMPH) ( Figura 3 ).

    Dichas células tienen la capacidad de autorrenovarse y son, tal como su nombre lo indica, potencialmente capaces de dar lugar a distintos tipos celulares. En el hombre, las CMPH aparecen en el saco vitelino embrionario alrededor de la tercera semana de vida y, a medida que el feto se desarrolla, algunas de estas células migran al hígado.

    Recién al cuarto mes de vida fetal la médula ósea comienza a ser el sitio donde mayoritariamente ocurrirá la hematopoyesis. Si bien en los adultos la mayor cantidad de CMPH se encuentra en la médula ósea, estas células tienen la capacidad de migrar hacia la circulación, por lo que puede hallarse una pequeña proporción en sangre periférica.

    A partir de las CMPH se generan dos tipos de progenitores con potencial pluripotente más acotado que se denominan: progenitor mieloide, el cual podrá diferenciarse en células de estirpe mieloide (eritrocitos, plaquetas, monocitos y granulocitos neutrófilos, basófilos y eosinófilos) y progenitor linfoide común (PLC), a partir del cual se generarán los linfocitos B y T.

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    Figura 3 ¿Dónde se desarrollan los linfocitos B? Los linfocitos B se desarrollan mayoritariamente en la médula ósea pero culminan su maduración en el bazo. Su generación se produce en distintas etapas o pasos que deben ir completándose, uno a uno, en forma correcta para poder avanzar en el proceso de maduración.

    El concepto mismo de maduración linfocitaria implica la generación de un receptor antigénico particular para cada linfocito y su expresión en la membrana antes del ingreso del antígeno. Dado que existen miles de millones de linfocitos B distintos, cada uno de los cuales porta inmunoglobulinas de superficie con una especificidad única, un individuo posee una gran diversidad de inmunoglobulinas.

    Tal como veremos a continuación, en las primeras etapas del desarrollo linfocitario, los esfuerzos se centran en la generación de esta Ig y, si esto no es posible, el linfocito no continúa con su desarrollo y se ponen en marcha mecanismos que llevan a la muerte celular programada conocida como apoptosis, sin alcanzar la madurez.

    ¿Cómo es posible generar tanta diversidad de inmunoglobulinas? Las inmunoglobulinas presentan muchísima diversidad. El número total de especificidades de anticuerpos disponibles en un individuo se conoce con el nombre de repertorio de anticuerpos o de inmunoglobulinas y en el ser humano, ese número, es por lo menos de cien mil millones.

    Antes de que se pudieran analizar directamente los genes que codifican para las Ig, existían dos teorías que intentaban explicar el origen de semejante diversidad. La TEORÍA DE LA LÍNEA GERMINAL postulaba que existía un gen distinto para cada cadena de Ig diferente y, por lo tanto, proponía que el repertorio de Ig era hereditario.

    • Por el contrario, la TEORÍA DE LA DIVERSIFICACION SOMÁTICA postulaba que el amplísimo repertorio se generaba a partir de un conjunto de genes hereditarios que codifican para la porción variable de las las Ig los cuales se modificaban de una manera particular en cada una de las células B.
    • El clonado de los genes de las Ig reveló que, tal como proponía esta última teoría, la generación de diversidad se produce por rearreglos del ADN que codifica para las porciones variables de las Ig durante el desarrollo de los linfocitos B.

    Las cadenas H y L de las Ig están codificadas por distintos grupos de genes y, para cada una de las cadenas, existen varios fragmentos génicos involucrados en la generación de sus porciones variables. En las células que darán lugar a los linfocitos B, estos fragmentos génicos se rearreglan a través de un proceso que se conoce con el nombre de recombinación somática (Figura 4),

    Receptores Que Expresan Los Linfocitos B

    Figura 4: Recombinación somática. La porción variable de la cadena L (V L ) se constituye por combinación de fragmentos denominados V (rojo) y J (amarillo), mientras que la región variable de la cadena H (V H ) involucra, además, fragmentos D (verde).

    Los fragmentos génicos presentes en el ADN en configuración germinal sufren el proceso de recombinación somática, dando lugar a una combinación única de fragmentos V-J para la porción V L y V-D-J para la región V H en cada linfocito B. Hasta aquí hemos visto de qué manera es posible que se constituya la porción variable de las cadena L y H pero, para simplificar, hemos presentado las cosas como si sólo existiera una copia de cada uno de los genes involucrados en el proceso de recombinación somática.

    En realidad, en el ADN en configuración germinal, existen múltiples copias de cada uno de los genes involucrados en este proceso y es la selección de un segmento u otro lo que hace posible la gran diversidad de regiones variables entre las distintas Ig.

    • La unión entre los fragmentos recombinados (V L -J L ó V H -D H -J H ) es imprecisa, lo cual es una fuente extra de variabilidad para la porción variable de las Ig.
    • Los rearreglos del ADN que generan proteínas no funcionales se denominan “no-productivos” y suelen ser los más frecuentes.
    • Para que un linfocito B pueda desarrollarse normalmente debe lograr un rearreglo productivo de su Ig, de no ser así, no podrá continuar con su desarrollo y morirá por apoptosis.

    Etapas de maduración de los linfocitos B Tal como hemos mencionado anteriormente, las células B maduran mayoritariamente en la medula ósea. El desarrollo de los linfocitos B depende de la presencia de células estromales que actúan, no sólo como una red de sostén necesaria para que los linfocitos B continúen su desarrollo, sino también como fuente de factores de crecimiento críticos que estimulan la diferenciación y proliferación.

    En el primer estadio de diferenciación, conocido con el nombre de estadio pro-B, los linfocitos poseen una capacidad limitada de auto-renovación. Durante este estadio es que se produce el rearreglo de la cadena H de las Ig, el cual se lleva a cabo en dos etapas: primero se asocian los fragmentos D H -J H (pro-B temprano) y luego se une el fragmento V H al D H J H previamente rearreglado (pro-B tardío).

    Tal como se observa en la Figura 5, la asociación D H -J H se produce en ambos cromosomas. Por el contrario, la unión del fragmento V H al D H J H se intentará primeramente en un cromosoma y en caso de no ser exitoso, se intentará rearreglar el segundo cromosoma.

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    Figura 5 La ausencia de rearreglos exitosos de la cadena H lleva a la apoptosis del linfocito B. El rearreglo productivo de la porción VH permite la expresión en la membrana de una cadena pesada m (H m ) asociada con dos proteínas producidas por el linfocito que están unidas en forma no covalente constituyendo una cadena liviana sustituta (Ls).

    • El ensamblado de la cadena H rearreglada a la cadena Ls y su asociación al heterodímero Ig a Ig b en la membrana del linfocito constituye el pre-BCR.
    • La presencia del pre-BCR en la membrana caracteriza el siguiente estadio de maduración denominado pre-B, en donde los linfocitos finalizan con los rearreglos de la cadena H, realizan varios ciclos de proliferación y comienzan posteriormente a rearreglar la cadena L.

    De esta manera, cada una de las células hijas de la progenie que poseen genes de cadena H ya rearreglados recombinan en forma independiente los fragmentos de la porción variable de la cadena L, aumentando nuevamente la diversidad. Para que todo esto sea posible, se necesita la transducción de señales de sobrevida del pre-BCR.

    1. Si bien hasta el momento no está claro qué es lo que gatilla la transducción de la señal a través de dicho receptor, existen evidencias que indican que la proteína quinasa Btk está involucrada.
    2. En este sentido, los pacientes que presentan mutaciones en dicha proteína (enfermedad de Bruton) poseen los linfocitos arrestados en el estadio pro-B.

    Los rearreglos de la porción variable de la cadena L también están gobernados por el fenómeno de exclusión alélica e involucran la asociación de fragmentos V L y J L. Existen dos tipos distintos de cadena L:, la cadena liviana kappa (L k ) o la lambda (L l ).

    • Primeramente se intentará un rearreglo productivo de la cadena L k en uno de lo cromosomas y, en los casos en que no se consiga, se procederá a intentar rearreglar esa misma cadena en el otro cromosoma.
    • Si estos intentos no fueran exitosos, comenzarán los rearreglos de la cadena L l, primero en un cromosoma y luego en el otro.

    Normalmente, un 65% de linfocitos B logra un rearreglo exitoso de cadena L k, mientras que el restante 35% presenta rearreglos productivos de la cadena L l, No existen linfocitos con rearreglos no productivos de cadena L ya que éstos no son viables y mueren por apoptosis.

    1. Una vez que los genes de la cadena L son rearreglados exitosamente, la cadena L comienza a sintetizarse y se combina con la cadena H m a fin de formar la molécula de IgM.
    2. Dicha molécula se expresará en la membrana junto con el heterodímero Ig a -Ig b constituyendo el BCR de clase IgM característico del estadio B inmaduro.

    En las etapas de maduración de los linfocitos B que hemos visto hasta el momento lo crucial es generar rearreglos productivos de los genes de cadena H y L que permitan la expresión de una molécula de Ig en la membrana. Aquellas células que logran generar su receptor antigénico y expresarlo pueden avanzar a la siguiente etapa de maduración, en donde los mecanismos de control cambian el foco de atención hacia la especificidad del BCR.

    • Es decir que, una vez que el linfocito alcanza el estadio B inmaduro y expresa el BCR en la membrana, dicho receptor será evaluado en función de su capacidad de reconocer antígenos presentes en el ambiente del órgano linfático primario.
    • La finalidad de esta “evaluación” es controlar a aquellos linfocitos cuyos BCR pueden reconocer moléculas propias, los cuales serían potencialmente peligrosos ya que podrían generar respuestas de tipo autoinmunes.

    Este proceso de “evaluación” se conoce como inducción de tolerancia central, La especificidad y la avidez del receptor por esos antígenos determinará el camino a seguir por el linfocito: sobrevivir y continuar madurando, o morir por apoptosis sin alcanzar la madurez.

    • Inducción de tolerancia central de linfocitos B Los linfocitos B inmaduros que no reciban señal alguna a través de su BCR en la médula ósea, son capaces de salir del órgano para continuar con su proceso de maduración en el bazo.
    • Por el contrario, aquellos linfocitos B inmaduros capaces de reconocer antígenos propios en la médula ósea son considerados peligrosos y “controlados” a través de diversos mecanismos dependiendo de la intensidad de la señal recibida por el BCR.

    Es así, que los que reciben una señal intensa a través del BCR morirán por apoptosis en la medula ósea. Antes de morir, al linfocito B inmaduro se le da la oportunidad de reemplazar el BCR autorreactivo por otro que no lo sea, a fin de evitar la muerte por apoptosis.

    Este proceso se conoce con el nombre de edición del receptor, Si el nuevo BCR generado no es autorreactivo, el linfocito B inmaduro no entra en apoptosis y sale de la médula ósea para continuar su proceso de maduración. Si los distintos intentos de “editar” el BCR continúan generando un receptor autorreactivo, la célula morirá por apoptosis en la médula ósea.

    Por otro lado, aquellos linfocitos B inmaduros que en la médula ósea reciban señales débiles a través de su BCR, serán inactivados y entrarán en un estado permanente de no-respuesta, también denominado anergia, Estos linfocitos autorreactivos abandonan la médula ósea pero, al no ser capaces de activarse en la periferia, mueren relativamente pronto.

    • Vale la pena mencionar que, dado que no todos los antígenos propios pueden alcanzar la médula ósea a fin de protagonizar la inducción de tolerancia central B, muchos de los linfocitos B que continúan con su proceso de maduración poseen BCR capaces de interaccionar con moléculas propias.
    • Dichos linfocitos son controlados en la periferia, a través de mecanismos de inducción de tolerancia periférica,

    Maduración periférica de linfocitos B Del total de linfocitos B inmaduros que se genera diariamente sólo un pequeño porcentaje logra salir de médula ósea y alcanzar el bazo, donde continúan con su proceso de maduración. ¿Por qué se generan tantos linfocitos B inmaduros y sólo algunos sobreviven? Todavía esta pregunta sigue sin tener una respuesta clara pero probablemente, la mayoría de los linfocitos B inmaduros sean seleccionados negativamente en la médula ósea durante la inducción de tolerancia central debido a que sus BCR son capaces de reconocer moléculas propias.

    1. Sólo aquellos linfocitos B inmaduros, que sobrevivan a la inducción de tolerancia central, saldrán de la médula ósea hacia el bazo, el órgano donde culminarán su maduración.
    2. En este estadio los linfocitos B, que se encuentran en la periferia en un estado de transición entre el estadio B inmaduro y maduro, reciben el nombre de linfocitos B transicionales (BTr).

    Dentro de esta población de linfocitos pueden diferenciarse dos subpoblaciones bien definidas, BTr de tipo 1 (BTr1) o de tipo 2 (BTr2), que se encuentran en el bazo ubicadas en distintos lugares anatómicos. Durante el estadio BTr1, los BCR de dichos linfocitos también son “controlados” y sufren un proceso de selección negativa si reciben señales a través de su BCR para reconocer moléculas propias.

    A través de este mecanismo de inducción de tolerancia periférica, nos aseguramos que los linfocitos B autorreactivos que han sobrevivido a la inducción de tolerancia central en la médula ósea no continúen su desarrollo y mueran por apoptosis en el bazo. Posteriormente, aquellos sobrevivientes, darán lugar a los BTr2, los cuales aparentemente necesitan recibir señales de sobrevida a través de su BCR, aún no bien definidas, para alcanzar el estadio de B maduro,

    Numerosas evidencias demostraron que es necesaria además la presencia de ciertos factores de sobrevida, tales como la citoquina BAFF, para la transición de los linfocitos BTr1 hacia el estadio BTr2 y B maduras. Una vez que los linfocitos han alcanzado su madurez, co-expresan en su membrana BCR de tipo IgM e IgD, sin embargo presentan una única especificidad dada por la porción variable de las Igs, que es idéntica.

    Esto se explica gracias a que una misma porción VH generada por recombinación somática puede asociarse con los genes C m (para dar la IgM) ó C d (para dar la IgD). Conclusiones Los linfocitos B, al igual que el resto de las células del sistema inmune, se originan en la médula ósea a partir de un precursor común.

    Existen miles de millones de linfocitos B distintos entre sí, cada uno de los cuales expresa en su membrana un receptor antigénico particular. La naturaleza se las ha ingeniado para generar semejante diversidad de receptores utilizando sólo un conjunto de genes, los cuales son rearreglados en forma distinta en cada uno de los linfocitos B en desarrollo.

    Debido a cómo se generan las inmunoglobulinas, una vez que el BCR puede ser expresado en la membrana, necesariamente deben existir mecanismos de control que evalúen la especificidad del mismo. Si bien durante la ontogenia de linfocitos B la mayoría de las células mueren por apoptosis antes de alcanzar la madurez, este proceso, lejos de ser un gasto innecesario de energía, mantiene el delicado equilibrio entre la diversidad y la autoinmunidad.

    El proceso de generación de las inmunoglobulinas nos asegura la gran diversidad necesaria para estar protegidos contra la amplísima variedad de microorganismos existentes, sin embargo esta situación acarrea conjuntamente la aparición de rearreglos capaces de interaccionar con moléculas propias.

    Es por ello que existen numerosos mecanismos de control para evaluar la especificidad de las inmunoglobulinas generadas, a fin de evitar la aparición de fenómenos autoinmunes. Aquellos linfocitos que sobreviven a los mecanismos de control y alcanzan el estadio B maduro, co-expresan en su membrana BCR de tipo IgM e IgD, los cuales son específicos para antígenos que aún no conocen, por lo que también reciben el nombre de linfocitos B vírgenes.

    Dichas células comienzan un tráfico linfocitario en busca del antígeno para el cual son específicas y, aquellas que lo encuentren, podrán activarse, proliferar y diferenciarse a células productoras de anticuerpos. Estos anticuerpos tendrán la capacidad de reconocer al antígeno específico y reclutar distintos mecanismos efectores a fin de destruirlo.

    Agradecimientos: A la Dra. Mirta Giordano, por su crítica revisión del manuscrito. Referencias. Tonegawa S., 1983. Somatic generation of antibody diversity. Nature, 302:575. D Zipori, 1992. The renewal and differentiation of hemopoietic stem cells. FASEB J., 6:2691. Gay D, Saunders T, Camper S,Weigert M., 1993.

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    ISSN 1666-7948 www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar

    Ontogenia linfocitaria y generación del BCR y TCR

    ¿Qué expresa el linfocito B?

    Los linfocitos B son responsables de la inmunidad humoral. Su función principal es la defensa del huésped contra gérmenes por medio de la secreción de anticuerpos que reconocen las moléculas antigénicas de los patógenos.

    ¿Qué CD expresan los linfocitos B?

    GENÉTICA ESTUDIOS INMUNOFENOTÍPICOS DE LOS LINFOCITOS B y T Marianela Trejos Herrera *, Virginia Chacón Zamora ** Summary Advances in immunological techniques in the last decade have made posible the identification of specific receptors, antigens and other molecules on the membrane and/or the cytoplasm of lymphoid cells.

    1. Beside morphological characterization, immunological marker analysis can further characterize the cells of the various hematopoyetic differentiation stages.
    2. Although immunological markers represent differentiation antigens, they usually are not specific for one differentiation stage, but are expressed in several stages.

    However, the expression of a specific set of markers can designate a cell to a particular differentation stage. Several markers are not restricted to one differentiation lineage, but are expressed in several lineages (B-, T- or myeloid lineage) The LLA and the chronic lymphocytic leukemias are the malignant counterparts of cells in immadure and more mature differentiation stages.

    • Introducción Fundamentos y aplicaciones de la Citometría de flujo en Hematología: La citometría de flujo ( CMF) constituye un método reciente e innovador de análisis celular a través del estudio de diversas propiedades fisicoquímicas y biológicas de la célula.
    • Su desarrollo se ha visto impulsado de forma importante por los avances ocurridos en los últimos años en campos tan diversos como la producción de anticuerpos monoclonales contra antígenos celulares, la química de los fluorocromos, la tecnología laser, las tinciones citoquímicas y la informática.

    Así, su empleo como una potente herramienta analítica incorporada a la infraestructura tecnológica previamente disponible ha supuesto su rápida difusión en las últimas décadas a un amplio conjunto de especialidades biomédicas como la inmunología, la hematología, la oncología, la anatomía patológica y la biología celular ( 3, 4, 11 ).

    1. Aplicaciones en Hematología: La caracterización de las diferentes poblaciones celulares normales de sangre periférica y médula ósea constituye una de las más extendidas e importantes aplicaciones actuales de la Citometría de Flujo.
    2. Si bien en un principio su utilidad se limito al análisis fenotípico de las células, el desarrollo de nuevos fluorocromos y anticuerpos monoclonales permite en la actualidad la valoración funcional de las mismas ( 4 ).

    Además de la caracterización morfológica, el análisis de marcadores inmunológicos pueden adicionalmente caracterizar las células de los varios estadíos de diferenciación hemopoyética. Aunque los marcadores inmunológicos representan antígenos de diferenciación, ellos usualmente no son específicos para un estado de diferenciación, sino que son expresados en diversos estados.

    • Sin embargo, la expresión de un grupo específico de marcadores pueden designar a una célula a un estadío de diferenciación particular ( 3 – 10 ).
    • Diferenciación Inmunofenotípica de Linfocitos B y T El precursor antigénico CD 34 es encontrado en la mayoría de las células inmaduras tanto linfoides como mieloides.

    El HLA-DR esta expresado en células inmaduras de la diferenciación hemopoyética (células tronco hemopoyéticas). Las células tronco totipotenciales solo presentan reactividad para CD34, pero también en células B, células monocíticas y linfocitos T activados.

    • La enzima TdT esta presente en el núcleo de células linfoides inmaduras, pero desaparece cuando son expresados los receptores antigénicos específicos ( 1 – 2, 8, 4, 6, 11 ).
    • Diferenciación de los linfocitos T: Los linfocitos T se originan a partir de un precursor linfoide en la médula ósea desde donde migran al timo para su diferenciación.

    Durante su maduración en el timo, los linfocitos T experimentan reagrupamientos genéticos que generan el receptor de la célula T (TCR) funcional. Este proceso se acompaña del desarrollo de otros antígenos. El esquema más aceptado en la actualidad divide a las células T inmaduras (timocitos) en tres estadíos de desarrollo, en los cuales la citometría de flujo ha desempeñado un papel fundamental ( 7, 11 ) (figuras 10 y 11 ). Figura 10. Esquema hipotético de diferenciación de células T humanas en análisis de inmunofenotípo de la LLA-T y timocitos de niños. Se indica el inmunofenotípo de las células T en los varios estados de diferenciación. Los marcadores inmunológicos en paréntesis no se expresan siempre. Las líneas punteadas representan los compartimientos tisulares donde se encuentran los varios tipos celulares.

    Figura 11. Esquema hipotético de diferenciación linfoide T. La Barras horizontales representan la situación endistintas leucemias agudas o crónicas, de acuerdo con su maduración. Figura 12. Un modelo para el blanco de las células T, esto es, la interacción de las células B y T con el antígeno presentado. Las células T restringidas a la clase I (citotóxicos, supresores) expresan el antígeno CD8 mientras que las células T restringidas a la clase II (cooperadoras) expresan el antígeno CD$, Las células que abandonan el timo son linfocitos T colaboradores/ inductores (CD4 +) caracterizados por restricción HLA de clase II y linfocitos T citotóxicos/ supresores (CD8 +) caracterizados por restricción HLA de clase I.

    • Las células en el estado de timocito maduro ( estadío III) expresan CD3 en la superficie, pierden el CDI y pueden expresar CD4 o CD8, pero no ambos.
    • El paso de timocito maduro a célula T periférico viene señalado por la pérdida de parte de su reactividad para el antígeno CD38.
    • Tras la selección tímica, menos del 1% de los linfocitos generados en el timo sobreviven y pasan a la circulación ( 7 ).

    Los linfocitos T periféricos pueden encontrarse en un estado de reposo o activados. Estos dos estados pueden diferenciarse por algunas características inmunofenotípicas. Tras la activación, los linfocitos T adquieren el receptor para la Interleucina 2.

    Además, los linfocitos T activados pueden expresar antígenos HLA-DR que normalmente no se expresan en reposo y el CD 71 que es el receptor para la transferrina ( 1, 2, 7 ). Otros antígenos de los, linfocitos T. Los antígenos CD2, CD3 y CD5 se encuentran presentes en todos los linfocitos T normales y un cuarto antígeno, el CD7, está presente en aproximadamente el 85% de las células T periféricas.

    Estos cuatro antígenos se denominan pan T. El antígeno CD2 es el lugar de unión de los hematíes de carnero en la formación de rosetas. El antígeno CD3 se encuentra unido de forma no covalente al receptor del antígeno de célula T y éste complejo es esencial para la activación dependiente del antígeno de los linfocitos T.

    • A su vez. El CD5 funciona como la molécula que une al antígeno BC72 ( 1, 7 ).
    • Diferenciación de los linfocitos B: Los linfocitos B se originan en la médula ósea donde experimentan una fase primaria de diferenciación.
    • La diferenciación de las células B va acompañada de una serie de cambios en el genotipo (reordenamientos en los genes de las inmunoglobulinas similar al del receptor TCR de los linfocitos T), y de la adquisición y pérdida en la membrana de una serie de antígenos.

    El desarrollo de las células B puede dividirse en tres estadíos amplios: células pre-B, que son los precursores de las células B inmaduras que no han adquirido aún las inmunoglobulinas de superficie; células B, células B maduras inmunocompetentes que expresan inmunoglobulinas de superficie y células plasmáticas, que son células de estirpe B diferenciadas terminalmente, que han perdido las inmunoglobulinas de superficie que funcionan para producir inmunoglobulina en cantidades masivas ( figura 13 ).

    La citometría de flujo ha sido fundamental en el establecimiento de las etapas de diferenciación de los linfocitos B ( 1, 7 ). El desarrollo de los marcadores de superficie de las células B es el siguiente: los precursores más inmaduros expresan solo los antígenos HLA-DR y el CD34, mientras que los antígenos CD19, CDIO y CD20 se van expresando secuencialmente, seguido de la expresión de las cadenas pesadas y citoplasmáticas y finalmente de las inmunoglobulinas de superficie.

    La transición de éste último estadío se acompaña de la pérdida del antígeno CD 10 ( 7, 11 ). Una vez que los linfocitos adquieren IgM de superficie, se considera que se han convertido en células B maduras. Las células B maduras expresan IgM de superficie y/o IgD, antígenos de clase 11, C3 y receptores Fc de IgG y los antigenos pan de células B.

    La mayoría expresan CD24 y CD21. Una pequeña fracción de células B de los adultos normales expresan el antígeno CD45. La diferenciación de las células B posterior a la médula ósea no se conoce muy bien y no es posible definir con exactitud los estadíos discretos por la expresión de antígenos particulares.

    Las células B terminalmente diferenciadas o células plasmáticas difieren fenotípicamente de la mayoría de células B. Carecen de los antígenos de clase II, del antígeno pan de leucocitos CD45 y de la mayoría, sino de todos los antígenos pan de células B.

    Se encuentran ausentes las inmunoglobulinas de superficie, aunque son abundantes las inmunoglobulinas citoplasmáticas ( 1, 7, 11 ). Antígenos característicos de los linfocitos B: Los antígenos específicos de los linfocitos B son CD19, CD20 y CD22. El antígeno CD 19 se expresa muy precozmente en el desarrollo de las células B y continúa su expresión hasta justo antes de la diferenciación en células plasmáticas.

    El CD20 se expresa más tardíamente que el CD19 en el desarrollo de los linfocitos B y parece estar relacionado con la expresión de las cadenas pesadas citoplasmáticas. El CD22 es específico de los linfocitos B y se pierde durante su transición a células plasmáticas ( 1, 7 ). Figura 13. Esquema hipotético de la diferenciación linfoide B y fenotipo observado en los correspondientes síndromes proliferativos. Las células NK ( asesinas naturales): Las células NK carecen de marcadores de células T o B específicos y tienen la capacidad de destruir células infectadas por virus y ciertas células tumorales, todo ello sin sensibilización previa (actividad natural).

    Las células NK se originan a partir de un precursor hemopoyético en la médula ósea, donde maduran y desde donde pasan a la circulación, sin embargo, su proceso de diferenciación se desconoce en gran medida. La citometría de flujo con marcaje múltiple ha sido fundamental en la caracterización fenotipica de estas células.

    La mayoría de células NK se caracterizan fenotipicamente por la expresión de CD2 y el pan T CD7. Las células NK expresan también las moléculas CD 11a-c Y CD 1 8 asociadas a función linfocitaria. Los antígenos CD16, CD56 y CD57 son marcadores que reconocen células con actividad NK, definiendo las células NK en ausencia de CD3/ TCR ( 1, 7 ).

    Resumen Durante la última década, avances en las técnicas inmunológicas han hecho posible la identificación de receptores específicos, antígenos y otras moléculas sobre la membrana o el citoplasma de las células linfoides. Además de la caracterización morfológica, el análisis de marcadores inmunológicos pueden caracterizar adicionalmente las células hemopoyéticas de los varios estados de diferenciación.

    Aunque los marcadores inmunológicos representan antígenos de diferenciación, ellos no son específicos para un estado de diferenciación, sino que se expresan en diversos estados. Sin embargo, la expresión de un grupo específico de marcadores puede asignar a una célula en un estado particular de diferenciación.

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    * Laboratorio Clínico, Hospital Calderón Guardia ** Laboratorio Clínico, Hospital San Vicente de Paul

    ¿Qué son los TCR y BCR?

    Resumen La recombinación V(D)J consiste en el ensamblaje de los segmentos génicos presentes en los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno para generar la diversidad del reconocimiento antigénico en linfocitos. El conocimiento de su regulación en condiciones normales es esencial para entender los casos en que este proceso se desregula, dando lugar a transformaciones leucémicas.

    • La recombinación V(D)J se inicia por acción de una endonucleasa específica presente exclusivamente en linfocitos inmaduros.
    • Según el «modelo de accesibilidad» propuesto hace más de 25 años, la recombinación V(D)J está regulada a través del control de la accesibilidad de esta endonucleasa a sus sitios de corte en el ADN, de acuerdo con unos programas de diferenciación celular muy definidos.

    En esta revisión se resumen los hallazgos descubiertos en este campo en los últimos años, tales como el importante papel que tiene la conformación génica y la posición de estos genes en el núcleo celular, así como aquellos que muy recientemente han permitido la validación definitiva del «modelo de accesibilidad».

    Palabras clave: Receptores de células T Inmunoglobulinas Recombinación V(D)J Cromatina Epigenómica Factores de transcripción Linfocitos Diferenciación celular Summary V(D)J recombination is the assembly of gene segments at the antigen receptor loci in order to generate antigen receptor diversity in T and B lymphocytes.

    Detailed knowledge of how V(D)J recombination is normally regulated during lymphocyte development is essential to understand the cases of dysregulation of this process that result in leukemic transformation. V(D)J recombination is triggered by action of a specific endonuclease which is exclusively expressed in immature lymphocytes.

    According to the “accessibility model” proposed more than 25 years ago, DNA cleavage by this endonuclease is very strictly controlled during cell differentiation by regulating its accessibility to chromatin. This review summarizes the advances in the field over the last few years, including the important role of the genomic conformation and position of the antigen receptor loci within the nucleus, as well as those that have recently culminated with the validation of the “accessibility model” to control this process.

    Keywords: T-cell receptors Immunoglobulins V(D)J recombination Chromatin Epigenomics Transcription factors Lymphocytes Cell differentiation Texto completo Estructura molecular del complejo de los receptores de antígeno en linfocitos T y B Existen 2 tipos de linfocitos, linfocitos T y B, los cuales maduran a partir de precursores linfoides comunes presentes en la médula ósea.

    Cada linfocito expresa un único tipo de receptor que reconoce un antígeno de forma específica, lo que se conoce como receptores clonotípicos. Los receptores de antígeno de los linfocitos T (TCR) reconocen antígenos peptídicos, presentados por las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad en la membrana de las células presentadoras de antígeno 1, mientras que los receptores de antígeno de los linfocitos B (BCR) reconocen antígenos solubles 2,

    A pesar de estas importantes diferencias funcionales, los TCR y los BCR tienen muchas características estructurales comunes 1,2, Ambos están formados por dímeros de cadenas peptídicas variables unidas por puentes disulfuro, las cuales son responsables del reconocimiento antigénico.

    1. Estas cadenas variables están asociadas a una serie de cadenas invariables, importantes para la expresión del receptor en membrana y para la transducción de las señales intracelulares ( fig.1 ).
    2. Las cadenas invariables también se asocian entre sí como dímeros.
    3. Los dímeros de cadenas invariables presentes en los TCR están formados por distintas asociaciones de miembros de la familia CD3: CD3¿δ, CD3γ¿ y CD3ζζ.

    Los dímeros de cadenas invariables presentes en los BCR están formados por miembros de la familia CD79: CD79αβ (también conocidos como Igαβ). Existen 7 cadenas variables de los receptores de antígeno: TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, IgH, Igκ e Igλ, que se emparejan entre sí, de forma específica, para generar los 4 posibles tipos de receptores de antígeno en linfocitos.

    Los linfocitos T pueden expresar 2 tipos de TCR, en función de las cadenas variables que expresen sus receptores de antígeno: TCRαβ o TCRγδ. La asociación específica de una cadena TCRα con una cadena TCRβ o de una cadena TCRγ con una cadena TCRδ da lugar a la generación de los 2 linajes de linfocitos T: los linfocitos Tαβ y los linfocitos Tγδ con funcionalidades diferentes 3,

    Los linfocitos B también pueden expresar 2 tipos de BCR en función de la expresión de las cadenas variables que expresen sus receptores de antígeno. La asociación de la cadena de inmunoglobulina pesada, IgH, con una de las 2 posibles cadenas de inmunoglobulina ligeras, Igκ o Igλ, da lugar a las inmunoglobulinas de membrana presentes en los BCR.

    Cada una de las cadenas variables consta de 2 regiones diferenciadas: una región variable extracelular localizada en el extremo amino terminal y una región constante localizada en el extremo carboxilo terminal ( fig.1 ). Las regiones variables de cada una de estas cadenas están encargadas del reconocimiento antigénico.

    Estas regiones contienen 3 tramos cortos de secuencias hipervariables 4 denominadas «regiones determinantes de complementariedad» (CDR)( fig.1 ). Hay un total de 6 CDR por receptor. La combinación tridimensional de los segmentos peptídicos constituidos por los CDR de cada cadena es lo que confiere una mayor especificidad de antígeno a cada receptor.

    1. La región constante de todas las cadenas variables de los receptores de antígeno, excepto las de las cadenas ligeras de inmunoglobulinas, incluye una región transmembrana y una región citoplásmatica corta.
    2. Estas regiones constantes tienen un papel importante en la interacción física y funcional de las cadenas variables con los dímeros de las cadenas invariables 1,2,

    Organización genómica de los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno Las regiones variables de las cadenas de los receptores de antígeno vienen determinadas por distintas combinaciones génicas de los segmentos V (variable), D (diversidad) y J ( joining ) que componen cada uno de los genes que las codifican ( Tcra, Tcrb, Tcrg, Tcrd, Igh, Igk, Igl ) 5,

    Los segmentos génicos V, D y J se encuentran en las regiones 5′ de cada gen con una distribución de segmentos muy conservada entre humano y ratón, mientras que los exones que dan lugar a las regiones constantes se encuentran en las regiones 3′ ( fig.2 ). Los segmentos V, D y J se reordenan a nivel génico durante el desarrollo de los linfocitos mediante un proceso denominado «recombinación V(D)J» 5,

    Este proceso permite la generación de un enorme repertorio de receptores para antígenos distintos en linfocitos T y B con una mínima inversión en material genético. Este proceso confiere una especificidad antigénica distinta a cada linfocito vírgen, lo que permite un reconocimiento prácticamente ilimitado de antígenos distintos.

    La existencia de este mecanismo de generación de los distintos TCR y BCR en linfocitos es la base de la inmunidad específica o adaptativa, a diferencia de la inmunidad innata. La inmunidad innata está implicada en la protección del huesped frente a los patógenos o antígenos extraños de una forma inespecífica.

    En la inmunidad innata tienen un papel importante tanto mecanismos celulares como moleculares. La inmunidad innata celular está basada en la activación de células que reconocen y responden frente a patógenos de forma inespecífica. Entre las células responsables de la inmunidad innata se encuentran los fagocitos, como los macrófagos, los neutrófilos y las células dendríticas, los basófilos y los eosinófilos, los mastocitos y las células asesinas naturales, además de las células que participan en la presentación de los antígenos a los linfocitos T.

    La inmunidad innata molecular está basada en el desencadenamiento de distintas cascadas, tales como la inflamación o el complemento. Ambas cascadas cooperan con la inmunidad específica para ayudar en la eliminación de los patógenos. Una diferencia fundamental entre los sistemas inmunitarios innato y adaptativo es que el primero no confiere inmunidad protectora al huesped a largo plazo.

    Regulación de los reordenamientos de los segmentos génicos V, D y J durante el desarrollo de los linfocitos Los linfocitos T y B proceden de un precursor linfoide común de médula ósea ( fig.3 ) donde se detectan reordenamientos D H -J H del gen Igh 3,6,

    Algunos de estos precursores migran al timo, donde reciben la señalización mediada a través de los receptores Notch, comenzando así la diferenciación del linaje de los linfocitos T 3, Los timocitos más inmaduros se denominan timocitos doble-negativos (DN) por carecer de la expresión de los receptores de superficie CD4 y CD8.

    Los timocitos DN pueden subdividirse en 4 estadios de diferenciación sucesivos en función de la expresión de los receptores CD25 y CD44: DN1 (CD25 – CD44 + ), DN2 (CD25 + CD44 + ), DN3 (CD25 + CD44 − ) y DN4 (CD25 – CD44 − ). Los timocitos DN1 son las células que acaban de migrar al timo desde la médula ósea y, por tanto, portan los reordenamientos D H -J H del gen Igh que ocurrieron anteriormente.

    En los timocitos DN2 y DN3 ocurren los reordenamientos productivos de los genes Tcrb, Tcrg y Tcrd, permitiendo la generación de los linfocitos Tγδ (en el caso de reordenamientos productivos de los genes Tcrg y Tcrd ) o la expresión de un pre-TCR (en el caso de un reordenamiento productivo del gen Tcrb ).

    El pre-TCR consiste en una cadena TCRβ y una cadena invariable denominada pre-Tα, asociadas a los dímeros de las cadenas invariables CD3 7, La señalización mediada a través del pre-TCR dispara la proliferación y la diferenciación de los timocitos DN3 a timocitos doble-positivos (DP) CD4 + CD8 +,

    A partir del estadio DN4, se detectan los primeros reordenamientos del gen Tcra, siendo estos muy abundantes en los timocitos DP. La expresión de un TCRαβ en las células DP inhibe la expresión de las proteínas RAG-1/2, inhibiéndose sucesivos reordenamientos en el gen Tcra, y permite su diferenciación a linfocitos Tαβ CD4 o Tαβ CD8 que migran fuera del timo como linfocitos Tαβ maduros.

    La diferenciación de los linfocitos B se rige por un esquema muy similar al de la diferenciación de los linfocitos T ( fig.3 ). Los precursores linfoides que permanecen en la médula ósea van diferenciando a través de distintos estadios intermedios (células pro-B, células pre-BI y células pre-BII) antes de dar lugar a los linfocitos B maduros 6,

    Tal y como ocurre durante el desarrollo de los linfocitos T, durante la maduración de los linfocitos B se activan sucesivamente los reordenamientos de los distintos genes de las cadenas de inmunoglobulinas. Primero reordena el gen de la cadena pesada, Igh, y después reordenan los genes de las cadenas ligeras, Igk e Igl,

    En las células pro-B ocurren los reordenamientos completos del gen Igh, lo que da lugar a la expresión de un pre-BCR en las células pre-BI. El pre-BCR consiste en una cadena IgH y 2 cadenas invariables, V-preB (1 o 2) y λ5, asociadas a las cadenas invariables CD79αβ.

    1. La señalización mediada a través del pre-BCR en las células pre-BI dispara su proliferación y su diferenciación a células pre-BII.
    2. En la fase de reposo que sigue a la proliferación mediada por esta señalización, en las llamadas células pre-BII pequeñas, ocurren los reordenamientos de los genes de las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas, Igk e Igl,

    La expresión de un BCR en estas células inhibe la expresión de las proteínas RAG-1/2, inhibiéndose futuros reordenamientos génicos, y permite su diferenciación a linfocitos B maduros que migrarán a periferia. Regulación de la recombinación V(D)J in vivo : «Modelo de accesibilidad» El proceso de recombinación V(D)J es específico de los genes de los receptores de antígeno ya que es dependiente de la presencia de una secuencia señal de recombinación (RSS) que flanquea cada uno de los segmentos génicos V, D y J 5 ( fig.2 ).

    El proceso de recombinación V(D)J se inicia cuando las proteínas Recombination Antigen Gene (RAG)-1 y RAG-2 reconocen juntas a 2 RSS compatibles de 2 segmentos génicos distintos (V y D, D y J o V y J), para formar un complejo sináptico 5, Para que 2 RSS sean compatibles se necesita que cumplan la llamada regla 12/23, por la cual una RSS ha de tener una secuencia espaciadora de 12 pares de bases y la otra una secuencia espaciadora de 23 pares de bases entre sus secuencias consenso de reconocimiento por las proteínas RAG-1/2.

    Una vez formado este complejo, las proteínas RAG-1/2, que juntas forman una endonucleasa, introducen un corte de doble cadena entre cada RSS y cada segmento génico a recombinar; por ejemplo, introducen un corte de doble cadena entre la unión de un segmento Vα y su RSS asociada y otro corte entre la unión de un segmento Jα y su RSS asociada para poder generar una recombinación VαJα.

    Estos cortes son procesados y ligados mediante la ruta de reparación de rupturas de doble cadena de ADN no homólogo. Las uniones que ocurren entre los segmentos génicos V-D, D-J o V-J se denominan uniones codificantes, mientras que las uniones que ocurren entre las RSS se denominan uniones no codificantes.

    Las uniones codificantes generan una nueva estructura genómica del gen que, en caso de ser productiva, será capaz de dar lugar a una cadena variable funcional de TCR o BCR. Las uniones no codificantes generan unos círculos extracromosómicos que contienen las secuencias génicas existentes entre los segmentos génicos que han sido reordenados.

    • Estos círculos extracromosómicos permanecerán en el núcleo celular de los linfocitos en reposo y solo desaparecerán por dilución cuando las células proliferen, ya que no tienen capacidad de replicación.
    • La especificidad génica de esta reacción viene dada por el hecho de que solo los segmentos génicos V, D y J de los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno están flanqueados por las RSS.

    Este hecho determina por qué son estos los únicos genes de todo el genoma que sufren el proceso de recombinación V(D)J. Por otro lado, existe también una especificidad que determina que este proceso ocurra exclusivamente en precursores linfoides, debido a que las proteínas RAG-1/2 solo se expresan durante la maduración de los linfocitos 5,

    • Sin embargo, existen otros niveles de regulación no explicados por la mera presencia de las RSS en estos genes o la expresión restrictiva de las proteínas RAG-1/2 en los precursores de linfocitos.
    • En concreto, se pueden distinguir 4 niveles adicionales de regulación ( i-iv ) 5,
    • I ) Control del linaje celular : que determina que los genes Igh, Igk e Igl solo reordenen de forma completa en precursores de linfocitos B y que los genes Tcra, Tcrb, Tcrd y Tcrg solo reordenen de forma completa en precursores de linfocitos T.

    ( ii ) Control temporal : que establece el orden en que ocurren los reordenamientos de estos genes durante el desarrollo de los linfocitos ( fig.3 ). Los reordenamientos de los genes Tcrb, Tcrg y Tcrd ocurren en timocitos DN2-DN3, mientras que los reordenamientos del gen Tcra ocurren en la transición de timocitos DN4 a timocitos DP tras recibir los timocitos DN3 una señalización a través del pre-TCR.

    1. Los reordenamientos del gen Igh ocurren en células pro-B, mientras que los genes Igl e Igk reordenan en células pre-BII tras recibir las células pre-BI una señalización a través del pre-BCR.
    2. Iii ) Control del orden de los reordenamientos entre los distintos segmentos génicos : que controla que los segmentos D y J de los genes Tcrb e Igh reordenen antes que los segmentos V; así, primero ocurren los reordenamientos DβJβ o D H J H y luego se completan los reordenamientos VβDβJβ o V H D H J H, respectivamente.

    ( iv ) Control de la exclusión alélica : que determina que solo se reordene de forma productiva uno de los 2 alelos en los genes Tcrb, Igh, Igk e Igl, Este fenómeno de exclusión alélica a nivel del reordenamiento génico determina que solo exista un tipo de receptor clonotípico en cada linfocito.

    • En los demás genes de las cadenas de los receptores de antígeno, Tcra, Tcrd y Tcrg, no existe exclusión alélica a nivel de los reordenamientos génicos.
    • Sin embargo, existe una exclusión alélica a nivel de la expresión de los TCR en la membrana celular que viene determinada por el mejor emparejamiento entre sí de unas determinadas cadenas variables de cada receptor respecto a otras durante el ensamblaje de los receptores 8,

    Por ejemplo, aunque puedan expresarse 2 cadenas TCRα en un timocito DP, una de ellas siempre tendrá una mejor afinidad que la otra para asociarse establemente con la cadena TCRβ expresada en esa célula. Este mecanismo de exclusión alélica a nivel del ensamblaje de los receptores en la membrana participa, junto con el otro mecanismo de exclusión alélica a nivel de reordenamientos génicos, en la expresión de los receptores clonotípicos en linfocitos T.

    Para explicar estos 4 niveles adicionales de control de la recombinación V(D)J a nivel génico, hace 25 años, G.D. Yancopoulos y F.W. Alt (1985) propusieron el llamado «modelo de accesibilidad» 9, Este modelo propone que la estructura de la cromatina, la cual es específica de cada gen de cadena variable de los receptores de antígeno y de cada estadio celular durante el desarrollo linfoide, determina la accesibilidad de las proteínas RAG-1/2 a las RSS y, por tanto, la propia especificidad y regulación de la recombinación V(D)J.

    Este modelo ha sido avalado por numerosos experimentos que han evidenciado que la activación de la recombinación V(D)J se correlaciona con una apertura de la cromatina y la presencia de determinadas marcas epigenéticas asociadas, tales como son la sensibilidad generalizada a las enzimas nucleasas, la activación de la transcripción, las modificaciones covalentes de las histonas relacionadas con la activación de la transcripción y la hipometilación del ADN 5,

    • Además, numerosos experimentos in vivo e in vitro han demostrado que la cromatina, en sí misma, representa una barrera física para la iniciación de la recombinación V(D)J, tal y como ocurre con el proceso de transcripción.
    • Así, el grupo de D.
    • Baltimore, en 1990, demostró que las proteínas RAG-1/2 son suficientes para activar la recombinación V(D)J de construcciones reporteras transfectadas en fibroblastos, pero no la de los genes endógenos de las cadenas variables de los receptores de antígeno 10, indicando que estos genes tienen una estructura de cromatina cerrada que impide su recombinación en otros tipos celulares distintos a los precursores linfoides.

    En 1996, el grupo de M. Schlissel demostró que estos genes tienen una estructura de cromatina distinta dependiendo del tipo celular y de su estadio de diferenciación, lo cual determina la accesibilidad de las proteínas RAG-1/2 en cada gen a lo largo de la diferenciación de los linfocitos B y T 11,

    1. Los ensayos in vitro, utilizando secuencias purificadas y proteínas RAG-1/2 recombinantes, han demostrado que la cromatinización del ADN inhibe la reacción de recombinación V(D)J 12,13,
    2. Estos experimentos, junto con el papel esencial demostrado por las secuencias reguladoras, tales como potenciadores ( enhancers) y promotores transcripcionales 5, han apoyado de forma sólida el «modelo de accesibilidad» en el control de la recombinación V(D)J.

    Como se muestra en la figura 2, todos los genes de cadenas variables de los receptores de antígeno contienen numerosos promotores transcripcionales asociados a múltiples segmentos génicos V, D y J, y uno o 2 enhancers situados cerca de las regiones constantes 5,

    • Los enhancers son los elementos responsables de la expresión génica específica de tejido 14,15, activando a promotores situados a largas distancias.
    • Estos elementos funcionan mediante el reclutamiento de factores de transcripción (FT) dando lugar al ensamblaje de unos complejos multiproteicos denominados enhanceosomas 16,

    Se acepta que, para que estos factores regulen los programas de expresión génica específica de tejido, múltiples FT han de unirse a los enhancers de una forma combinatorial, explicando así la gran diversidad existente de enhancers y programas de diferenciación génica.

    1. Una vez unidos a los enhancers, los FT reclutan otros complejos proteicos y enzimáticos para la activación de la transcripción génica, tales como el denominado complejo mediador, las enzimas modificadores de histonas y los complejos remodeladores de cromatina.
    2. El complejo mediador dirige la unión de los FT a los promotores y a los enhancers, facilitando las interacciones físicas entre ambos 17,

    Los complejos modificadores de la cromatina y las enzimas modificadoras de histonas funcionan cambiando la estructura de la cromatina en el área de influencia de los enhancers 18, Los complejos modificadores de la cromatina, tales como el complejo SWI/SNF, reposicionan o eliminan nucleosomas a lo largo del ADN de una forma dependiente de ATP 19, siendo responsables de la creación de regiones libres de nucleosomas que, a su vez, facilitan el reclutamiento de otros FT dentro de un enhancer,

    1. Por otro lado, las enzimas modificadoras de las histonas son las responsables de las marcas epigenéticas que definen la estructura de la cromatina de un determinado gen.
    2. Los estudios epigenéticos han demostrado que los enhancers se caracterizan por tener marcas epigenéticas comunes, tales como altos niveles de acetilación de la histona H3, altos niveles de monometilación de la lisina 4 de la histona H3 (H3K4me1), bajos niveles de trimetilación de H3K4 (H3K4me3) y altos niveles de acetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27ac) 15,20,21,

    Dentro de estas marcas, los altos niveles de H3K4me1 y los bajos niveles de H3K4me3 son altamente predictivos de la identidad de un enhancer, mientras que los altos niveles de H3K27ac son altamente predictivos de su actividad 20, En cuanto a las marcas epigenéticas para la identificación de otros elementos reguladores destacan los altos niveles de H3K4me3, descritos para la identificación de promotores activos, y el reclutamiento del factor de unión a la secuencia CCCTC (CTCF), descrito para la identificación de secuencias aisladoras 15,

    Los estudios realizados a gran escala han establecido que los enhancers son los elementos responsables de dirigir los programas de diferenciación celular, mediante la formación de plataformas moleculares constituidas por FT constitutivos específicos de tejido, capaces de guiar la unión de FT inducibles en respuesta a señales extracelulares 15,18,

    Los enhanceosomas formados por FT constitutivos constituirían un estado preactivado del enhancer, permitiendo que este responda rápidamente a una señalización. De acuerdo con estos datos, nuestros experimentos de caracterización de los distintos enhanceosomas ensamblados en el enhancer del gen Tcra (Eα), durante el desarrollo de los timocitos ( fig.4 A), han determinado que Eα se encuentra en un estado inactivo y ocupado por numerosos FT constitutivos en timocitos DN3, tales como CREB, Ets-1, Fli-1, GATA-3, y las proteínas E2A y HEB, constituyendo una plataforma molecular para el rápido reclutamiento de FT inducibles por la ruta de activación del pre-TCR en timocitos DN4-DP, tales como NFAT, AP-1 y Egr-1, pasando así a un estado activo 22,23,

    1. Por tanto, el ensamblaje combinatorial de FT constitutivos e inducibles dicta la activación de Eα durante el desarrollo de los timocitos.
    2. Este mecanismo de activación de enhancers inducibles, específicos de tejido, parece representar un paradigma general en la regulación de la expresión génica en respuesta a una señalización extracelular.

    Múltiples estudios funcionales han establecido el papel esencial de los enhancers presentes en los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno en el control de la recombinación V(D)J, tanto mediante su deleción en el genoma de ratón (ratones knock-out ) o mediante su integración en construcciones reporteras de recombinación V(D)J transfectadas en células o microinyectadas en oocitos de ratón (ratones transgénicos) 5,

    • Por ejemplo, la deleción del enhancer presente en un gen concreto inhibe específicamente la transcripción y el reordenamiento génicos de ese gen.
    • Estos datos funcionales se correlacionan con la disminución de las marcas epigenéticas relacionadas con la actividad de ese enhancer, lo cual se traduce en una inaccesibilidad del complejo de la ARN polimerasa ii (Pol-II) a los promotores y de las proteínas RAG-1/2 a las RSS presentes en el área de influencia del enhancer,

    Por tanto, los enhancers son los elementos controladores de la accesibilidad a largas distancias, actuando como iniciadores de la apertura de la cromatina en grandes regiones del genoma y controlando la activación de la transcripción y del reordenamiento génicos durante el desarrollo.

    1. Los promotores, por otro lado, dirigen la iniciación de la transcripción desde sitios concretos, proporcionando una plataforma para el reclutamiento del complejo de la Pol-II y dirigiendo la recombinación V(D)J de un segmento o un grupo de segmentos génicos concretos 5,
    2. Las evidencias experimentales demuestran que los promotores modifican la estructura de la cromatina a nivel local a diferencia del papel más global que ejercen los enhancers,

    Por ejemplo, ( i ) la deleción del promotor asociado al segmento Dβ1 inhibe la transcripción y la recombinación de ese segmento génico en concreto, dentro del grupo de segmentos génicos Dβ1Jβ, sin afectar al grupo de segmentos génicos Dβ2Jβ 24 ; ( ii ) la deleción del promotor asociado al segmento génico Vβ14 inhibe su transcripción germinal y su recombinación sin afectar a los demás segmentos génicos Vβ 25 ; ( iii ) en el caso del gen Tcra, los promotores TEA y Jα49p dirigen los reordenamientos que afectan a los segmentos Jα génicos situados inmediatamente 3′ del promotor, sin afectar a los situados más 3′ en el gen 26,

    En conjunto, estas observaciones indican que, en contraste con la acción global realizada por los enhancers en los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno, los promotores tienen un efecto localizado en la estructura de la cromatina, estando su efecto restringido a uno o a unos pocos segmentos génicos.

    Es interesante destacar el papel de Eα y los promotores asociados a los segmentos Jα y Vα en la regulación de los reordenamientos sucesivos que ocurren en el gen Tcra durante el desarrollo de los timocitos ( fig.4 B) con el fin de maximizar las oportunidades para expresar una cadena TCRα productiva 27,

    Los primeros reordenamientos VαJα que ocurren en el gen Tcra se denominan reordenamientos primarios y afectan a los segmentos Vα proximales y a los segmentos Jα distales (en función de su distancia con respecto a la localización de la región Cα). Los reordenamientos primarios ocurren en la primera fase de diferenciación de los timocitos DN3 a DP: timocitos DN4 y DP tempranos 28,

    Si los reordenamientos VαJα primarios resultan improductivos se activan subsecuentes reordenamientos VαJα denominados reordenamientos secundarios en timocitos DP tardíos 27, Los reordenamientos secundarios afectan a los segmentos Vα distales y a los segmentos Jα proximales (en función de su distancia con respecto a la localización de la región Cα).

    1. Los mecanismos moleculares implicados en la activación de los reordenamientos primarios y secundarios del gen Tcra son muy distintos entre sí.
    2. La activación de los promotores TEA y Jα49p por Eα es responsable de la activación de los reordenamientos VαJα primarios en respuesta a la señalización que reciben los timocitos DN3 a través del pre-TCR 26,

    Nuestros recientes estudios in silico y de validación de sitios de unión para FT en las secuencias de estos promotores revelan la presencia de numerosas secuencias específicas para la unión de FT constitutivos e inducibles, tales como TCF-1/LEF-1, Egr, NFAT y AP-1, entre otros (datos no publicados), de una forma similar a como ocurre en Eα 23,

    La activación de TEA por FT inducibles podría constituir las bases moleculares para explicar su capacidad de responder a la señalización mediada por el pre-TCR, activando los reordenamientos VαJα primarios en timocitos DN4 y DP tempranos, y de no responder a la acción del enhancer del gen Tcrd, Eδ, en timocitos DN2-DN3 29,

    Los reordenamientos secundarios se activan como consecuencia de la apertura de la cromatina de los segmentos Jα proximales, mediada por el acercamiento de los promotores Vα distales, los cuales se activan de forma independiente de Eα como consecuencia de los reordenamientos primarios 30,

    La activación de los promotores Vα distales no es dependiente de Eα y promueve la apertura de la cromatina de los segmentos Jα proximales, permitiendo así los reordenamientos VαJα secundarios sucesivos que ocurren en el gen Tcra 30, La naturaleza de la arquitectura de los genes, que codifican para las cadenas variables de los receptores de antígeno con los enhancers y promotores situados a largas distancias entre sí, precisa del establecimiento de puentes moleculares entre estos elementos para la activación de la transcripción y la recombinación V(D)J.

    La existencia de interacciones físicas directas entre promotores y enhancers ha sido demostrada experimentalmente en los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno mediante la técnica de captura de la conformación cromosómica 31–33,

    • En el caso de la activación del gen Tcra se ha demostrado además que la interacción entre Eα y el promotor TEA está facilitada por la unión de CTCF y sus cohesinas asociadas 33,
    • Aunque CTCF y las cohesinas puedan tener un papel importante en la mediación de la interacción física entre ambas secuencias y en la formación del lazo intracromosómico resultante, los FT unidos a los promotores TEA/Jα49p y Eα podrían ser esenciales en esta interacción mediante la formación de un holocomplejo funcional ( fig.5 ).

    Es interesante destacar que interacciones entre FT que se unen a Eα y los promotores TEA y Jα49p, tales como LEF-1 y AP-1, se han demostrado capaces de mediar lazos intramoleculares entre regiones 5′ y 3′ distantes en el genoma para la activación de la transcripción 34,

    Validación experimental del «modelo de accesibilidad»: los enhancers, los promotores y la elongación transcripcional son esenciales para el reclutamiento de las proteínas RAG-1/2 El «modelo de accesibilidad» estaba basado en la observación de que la transcripción germinal (transcripción iniciada en los promotores de los segmentos génicos no reordenados de los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno) se correlaciona con la activación de la recombinación V(D)J durante el desarrollo de los linfocitos 9,

    Hasta hace pocos años se pensaba que la transcripción germinal era el resultado inherente de la accesibilidad de la cromatina impartida por la activación de promotores y enhancers, de tal forma que la activación de estos elementos regularía conjuntamente la accesibilidad de las proteínas RAG-1/2 y la Pol-II al ADN mediante una apertura general de la estructura de la cromatina.

    El grupo de M.S. Krangel demostró que la elongación transcripcional, a lo largo de los segmentos Jα, media la activación de los reordenamientos VαJα 35, Estos investigadores introdujeron una secuencia bloqueadora de la elongación transcripcional en medio de los segmentos génicos Jα e inhibieron la recombinación VαJα de los segmentos Jα situados inmediatamente 3′ de la región bloqueadora.

    Estos resultados han sido concluyentes para determinar que la elongación transcripcional en sí misma, procedente de los promotores asociados a los segmentos Jα, tiene un papel causal en la iniciación de la recombinación VαJα. La regulación de la recombinación V(D)J mediada por la elongación transcripcional parece ser esencial en el control del reordenamiento V(D)J en genes largos, tales como el gen Tcra, en los que la accesibilidad de la cromatina de las RSS de los segmentos Jα, dirigida por la activación de los promotores, necesita propagarse a varios segmentos génicos Jα que carecen de promotor.

    En el caso de segmentos génicos que tengan asociados un promotor en exclusiva no haría falta la elongación transcripcional para activar su recombinación. En estos casos, el simple ensamblaje del complejo de la Pol-II a esos promotores abriría la cromatina permitiendo el acceso de las proteínas RAG-1/2 a las RSS asociadas a esos segmentos génicos.

    Aunque todos los datos anteriormente descritos apoyan el «modelo de accesibilidad», este no ha sido validado de forma definitiva hasta muy recientemente por los grupos de D.G. Schatz y M.S. Krange mediante el análisis de la unión in vivo de la proteína RAG-1 a los RSS en los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno durante el desarrollo de los linfocitos 36,37,

    1. La proteína RAG-2 reconoce una marca de cromatina abierta, H3K4me3, a lo largo de todo el genoma en los precursores de los linfocitos 38,39,
    2. Por tanto, RAG-2 se encuentra unida a toda la cromatina activa en estas células, independientemente que se trate o no de las RSS.
    3. Sin embargo, la proteína RAG-1 solo reconoce a las RSS accesibles 36,37, por lo que su unión es predictiva de una recombinación V(D)J activa.

    Por tanto, el reclutamiento de RAG-1, y no de RAG-2, es lo que determina la especificidad de la recombinación V(D)J. En estos experimentos 36,37 se analizó el reclutamiento de RAG-1 por inmunoprecipitación de cromatina a los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno y se observó que los promotores, los enhancers y la transcripción activa son todos esenciales para que RAG-1 pueda ser reclutada a determinadas RSS, validando de forma definitiva el «modelo de accesibilidad» 9,

    En resumen, estos estudios han demostrado que el control de la recombinación V(D)J ocurre a través de la regulación de la accesibilidad de las RSS a la proteína RAG-1 (que funciona en conjunción con la proteína RAG-2) mediada a través de la activación de las secuencias reguladoras presentes en cada gen y de la elongación transcripcional.

    Actualmente, se desconoce el mecanismo molecular del reclutamiento de la proteína RAG-1 a través de la elongación transcripcional, pero probablemente esté mediada por la apertura de la cromatina que acompaña o es consecuencia del paso del complejo de la Pol-II.

    Papel de la conformación génica y de la localización nuclear de los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno en la regulación de la recombinación V(D)J Aunque está aceptado que la accesibilidad de la cromatina es fundamental para que la recombinación V(D)J pueda tener lugar, se ha demostrado que esta no es suficiente en algunos casos 40, existiendo otro nivel de regulación que se ha denominado «más allá de la accesibilidad».

    Este nivel de regulación adicional depende de 2 procesos que ocurren en los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno a nivel nuclear: cambios de la conformación génica y cambios de la localización subnuclear. Mediante experimentos de hibridación in situ con sondas fluorescentes para las regiones proximales y distales, analizados por microscopía confocal (3D-FISH), el grupo de J.A.

    1. Skok demostró que la conformación génica y la localización en el núcleo de los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno tienen un papel fundamental en el proceso de recombinación V(D)J 41,
    2. Así estos genes pueden encontrarse en configuraciones extendidas o contraídas como consecuencia de la separación o yuxtaposición de las regiones V con las regiones J, respectivamente.

    De hecho, la contracción de un gen ocurre en el mismo momento en que ese gen se transcribe y está listo para ser recombinado, incluso en ausencia de las proteínas RAG-1/2 41, Un ejemplo interesante de regulación de la conformación génica ha sido revelado en el análisis del locus Tcra/Tcrd por el grupo de M.S.

    1. Rangel 42,
    2. Este locus contiene 2 genes que codifican para 2 cadenas variables de los receptores de antígeno, Tcrd y Tcra ( fig.2 ), con distintos programas de recombinación y expresión durante el desarrollo de los timocitos ( fig.3 ).
    3. Cada alelo del gen Tcrd solo tiene una oportunidad para reordenar sus segmentos génicos en timocitos DN2-DN3 y, por ello, los segmentos Vδ, que están distribuidos a lo largo de toda la región Vα/δ, deben tener las mismas oportunidades de reordenarse en estas células.

    De forma coherente con esta situación, los experimentos de 3D-FISH del locus Tcra/Tcrd han mostrado que esta región se encuentra totalmente contraída en timocitos DN3 ( fig.6 A). En timocitos DP, el gen Tcra puede sufrir múltiples rondas de reordenamientos VαJα hasta conseguir una cadena TCRα capaz de ensamblarse con la cadena TCRβ ( fig.4 B).

    Para favorecer los reordenamientos sucesivos del gen Tcra primero se activa Eα por la señalización mediada por el pre-TCR en timocitos DN4 y DP tempranos, lo cual dispara la transcripción mediada por los promotores de los segmentos Vα proximales y de los segmentos Jα distales, TEA y Jα49p, para generar los reordenamientos primarios.

    Como consecuencia de estos reordenamientos primarios, y si estos no han resultado productivos, se activan los reordenamientos secundarios que afectan a los segmentos Vα distales/centrales y a los segmentos Jα proximales. De forma coherente con esta situación, los experimentos de 3D-FISH han mostrado que la región que contiene los segmentos Vα distales y centrales se encuentra en una configuración extendida en timocitos DP, lo cual favorecería un uso secuencial 5′-3′ de los segmentos Vα ( fig.6 A).

    Se desconoce el mecanismo molecular responsable de la contracción de los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno. Los análisis de la conformación génica del locus Tcra/Tcrd, en ausencia de Eα o Eδ, han demostrado que los enhancers no están implicados en la yuxtaposición de las regiones distales con las regiones proximales del locus 42,

    Recientemente se ha evaluado la posible contribución de CTCF en este proceso 43–45, Los datos obtenidos indican que, aunque este factor media en la regulación de la recombinación V(D)J, CTCF no es el responsable de la contracción génica de los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno 44–46,

    Otros candidatos que podrían mediar en la contracción génica de estos genes incluyen determinados FT, tales como Pax5, Ikaros, YY1, el factor X de células pro/pre-B y las proteínas E 41, También se postula que la transcripción por sí misma esté implicada en la regulación de la conformación génica de las cadenas variables de los receptores de antígeno.

    Durante los últimos 10 años se ha demostrado que la localización nuclear de estos genes tiene también un papel fundamental en la regulación de la recombinación V(D)J. Así, para que un gen recombine, se necesita que ese gen se encuentre fuera de las zonas represivas del núcleo (alejado de las regiones que contienen la heterocromatina y de la lámina interna del núcleo) 41,47,

    1. Además, en el caso de los genes de las cadenas variables de los receptores de antígeno que sufren exclusión alélica, se ha observado que la asociación de estos genes con compartimentos nucleares represivos tiene un papel fundamental en este proceso 41,47,
    2. La exclusión alélica de los genes Igh y Tcrb se regula a través de su fuerte tendencia a asociarse con compartimentos nucleares represivos, lo cual determina una reducida eficiencia de recombinación, contribuyendo así a que las posibilidades de que ambos alelos reordenen simultáneamente sean muy bajas 48,49,

    En el caso del gen Igk, el mecanismo que regula su exclusión alélica es distinto. El ADN de los 2 alelos de este gen están diferencialmente metilados, lo que determina su distinta predisposición a asociarse con las áreas represivas del núcleo y a sufrir recombinación 50,

    Actualmente se desconocen los elementos reguladores y los factores implicados en la asociación de determinados genes de cadenas variables de los receptores de antígeno con compartimentos represivos nucleares. En la figura 6 B se resumen los cambios detectados en la conformación génica y localización nuclear de los genes Igh e Igk durante el desarrollo de los linfocitos B 41,

    En los progenitores linfoides de linfocitos T y B ambos genes están transcripcionalmente inactivos. Los estudios mediante 3D-FISH de estos genes en estos estadios tempranos indican que estos genes tienen una conformación génica extendida y se encuentran asociados a la lámina interna de la membrana nuclear.

    1. Los progenitores linfoides maduran en médula ósea, recibiendo una señalización a través de IL-7 6,
    2. En las células pro-B, el gen Igh sufre una relocalización nuclear hacia regiones transcripcionalmente activas, un cambio de su conformación génica a una configuración contraída y un emparejamiento de los 2 alelos del gen a través de los segmentos V H, todo lo cual permite el reordenamiento V H a D H J H en uno solo de los alelos.

    No se conoce el mecanismo que media en el emparejamiento de los 2 alelos Igh, pero ocurre de forma dependiente de la presencia de las proteínas RAG-1/2. Si ese reordenamiento es improductivo se inicia el reordenamiento en el otro alelo del gen Igh, En las células pro-B el gen Igk continúa con una conformación génica extendida y asociado a la membrana nuclear.

    • En células pre-BI el alelo correctamente reordenado del gen Igh se expresa y se encuentra en zonas transcripcionalmente permisibles del núcleo, mientras que el alelo Igh no reordenado se asocia con las áreas nucleares de heterocromatina para inhibir su posible recombinación.
    • La recombinación V H D H J H productiva de uno de los alelos del gen Igh permite su expresión en la membrana celular junto con las cadenas invariables V-preB y λ5 para dar lugar al pre-BCR, lo cual transduce una señalización intracelular que dirige la diferenciación de las células pre-BI a células pre-BII.

    En las células pre-BII grandes, no hay expresión de proteínas RAG-1/2 por lo que la recombinación V(D)J está inhibida. En estas células, los alelos del gen Igk sufren una contracción de su conformación génica, a la vez que estos se asocian con áreas de heterocromatina.

    1. El alelo Igh no reordenado (o reordenado improductivamente) se asocia junto con los alelos del gen Igk en zonas de heterocromatina, sufriendo una descontracción en su conformación génica.
    2. En células pre-BII pequeñas, las proteínas RAG-1/2 vuelven a reexpresarse.
    3. Esto permite el reordenamiento Vκ-Jκ de un alelo del gen Igk que se ha movido hacia posiciones del núcleo permisivas para la transcripción y el reordenamiento génicos.

    Si este reordenamiento resulta improductivo se activa el mismo proceso en el otro alelo del gen Igk. El alelo no reordenado (o reordenado de forma improductiva) del gen Igh permanece asociado con la heterocromatina y con una configuración extendida, reforzándose la exclusión alélica de este gen mediante la inhibición del reordenamiento V H a D H J H,

    El alelo del gen Igh que sufrió un reordenamiento productivo en las células pro-B permanece transcripcionalmente activo y se encuentra localizado en las áreas permisivas del núcleo celular en células pre-BII. El correcto reordenamiento de uno de los alelos del gen Igk permite la expresión de una cadena Igk que se empareja con la cadena Igh para la expresión de un BCR en la membrana celular, dando lugar a la diferenciación de las células pre-BII a linfocitos B.

    En los linfocitos B ambos alelos de cada gen tienen una configuración extendida y se encuentran en regiones transcripcionalmente permisivas. De esta forma, se asegura que solo un alelo de cada gen, Igh e Igk, porte un reordenamiento productivo y solo se exprese un tipo de receptor clonotípico en cada linfocito B vírgen.

    En resumen, podemos concluir que las evidencias experimentales indican que la accesibilidad de la cromatina, junto con la conformación génica y la localización subnuclear de los genes que codifican para las cadenas variables de los receptores de antígeno de linfocitos, regulan de forma conjunta el proceso de recombinación V(D)J 37,41,47,

    Financiación El trabajo presentado está financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2009-08796), la Junta de Andalucía (CTS-6587 y CVI-4526) y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (201020E060), parcialmente financiados con fondos FEDER de la Unión Europea.

    Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Bibliografía K.W. Wucherpfennig, E. Gagnon, M.J. Call, E.S. Huseby, M.E. Call. Structural biology of T-cell receptor: insights into receptor assembly, ligand recognition, and initiation of signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2 (2010), pp.1-14 B.

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    ¿Qué linfocito expresa CD3?

    El antígeno CD3 lo expresan los linfocitos T maduros y un subconjunto de timocitos.

    ¿Qué marca CD5?

    Linfoma B o T Aunque la distincin entre linfomas B y T no es siempre clnicamente relevante, constituye un prerrequisito para el reconocimiento de entidades biolgicas, ensayos clnicos y proyectos de investigacin. Habitualmente la identificacin inmunofenotpica de un linfoma como B T resulta relativamente sencilla si la composicin celular es homognea y monomrfica.

    1. En esta circunstancia la demostracin de uno o ms marcadores B por la mayora de la celularidad tumoral, en ausencia de marcadores T, suele asegurar lnea celular B, y lo mismo, pero al revs, para lnea T.
    2. Los problemas suelen presentarse cuando la composicin celular es polimrfica, no claramente atpica e incluye una gran cantidad de celularidad acompaante de carcter reactivo.

    En cada grupo los ejemplos ms representativos son el linfoma B rico en clulas T y los linfomas perifricos de clulas T de bajo grado. Probablemente el marcador ms extendido para reconocer linfocitos B maduros (no clulas plasmticas ni sus proliferaciones o tumores) sea el CD20, una fosfoprotena no glicosilada de membrana (Chang et al, 1996), que puede reconocerse fcilmente mediante el Ac Mo L26.

    1. Las precauciones que es preciso tomar en la interpretacin de tinciones positivas es la coexpresin por una pequea poblacin de clulas T en sangre perifrica y mdula sea (Algino et al, 1996); en leucemias mieloides agudas y crnicas y en las clulas epiteliales de los timomas.
    2. El CD20 tambin es til en el diagnstico de enfermedad de Hodgkin, tipo predominio linfoctico nodular, teniendo en cuenta que conforme se van mejorando las tcnicas de desenmascaramiento, el nmero de casos positivos (clulas de Hodgkin y de Reed-Stemberg) de enfermedad de Hodgkin clsica va en aumento (Zukerberg et al, 1991).

    Aproximadamente la mitad de linfomas linfoblsticos B son positivos para CD20, mientras que los mielomas/plasmocitomas son negativos. CD79a, tambin conocido como mb-1, es una glicoproteina que junto con la subunidad beta constituye un dmero que se presenta en clulas B asociado a las Ig de superficie (Mason et al, 1995), constituyendo el receptor de las clulas B (BCR) de manera anloga a lo que representa CD3 en los linfocitos T (TCR).

    1. No aparece en lnea mieloide ni T, ni tampoco en sus tumores, con la excepcin de leucemias promielocticas.
    2. Puesto que reacciona con clulas B normales y tumorales en todos los estadios del desarrollo, se encuentra tambin en mielomas, lo que le hace ms til que el L26 en este campo.
    3. Para la deteccin de enfermedad mnima residual de leucemia linfoblstica aguda, CD79a se ha revelado como de mayor utilidad que CD20 (Brousset P et al, 1996).

    CD5, un marcador de clulas T, suele ser positivo en varios linfomas B de bajo grado, como LLC-B, linfoma linfoctico de clulas pequeas y linfoma de clulas del manto, y negativo en otros, como linfoma folicular. Otro marcador T, CD43, es positivo frecuentemente en linfomas difusos B y LLC-B y generalmente negativo en linfoma folicular.

    1. Como en el caso de los linfomas B, los linfomas T se identifican inmunofenotpicamente por la deteccin de uno o ms marcadores de clulas T como CD2, CD3, CD5 y CD7, en ausencia de Ag asociados a clulas B.
    2. La escasa especificidad de todos ellos aconsejan utilizarlos en forma de panel de una forma ms estricta todava que en el caso de los marcadores B.

    En la actualidad, todos ellos pueden estudiarse en parafina. La mayora de linfomas linfoblsticos T presentan tres o cuatro de los Ac mencionados y los linfomas perifricos de clulas T dos o ms. Las clulas normales y tumorales NK tambin se tien con todos ellos, excepto con CD5 (Spits et al, 1995).

    Solo los Ac Mo dirigidos contra los eptopos beta (betaF1) y cadena delta (anti-TCR delta-1) puede decirse que sean especficos de las clulas T. El fenotipo de clula T precursora puede ser reconocido mediante TdT+, CD1a+, CD4+CD8+ CD4-CD8-. Aunque los primeros Ac disponibles en parafina para CD5 slo tean clulas normales y no linfomas B, la clona NCL-CD5-4C7, tie en condiciones tcnicas adecuadas, la mayora de LLC-B y linfomas del manto (Kaufmann et al, 1997).

    Recientemente se ha comunicado que la amplificacin con tiramida ofrece buenos resultados en el estudio de estos Ac (Malisius et al, 1997). La molcula CD3 est constituida por cinco cadenas polipeptdicas designadas gamma, delta, epsilon, zeta y eta. Tanto el Ac Po como el Ac Mo CD3 estn dirigidos contra la unidad epsilon de la molcula CD3, un dominio intracitoplsmico que adems de ser un marcador pan-T, est presente en clulas NK activadas y tumorales (Spits et al, 1995).

    • Aproximadamente el 95% de las clulas T expresan CD3, y prcticamente no se conocen otro tipo de clulas distintas que lo expresen, con la nica excepcin de las clulas de Purkinje.
    • La mayora de los tumores de clulas T son positivos en parafina para CD3, aunque en raras ocasiones es posible que el proceso neoplsico lo negativice, como puede ocurrir en el linfoma anaplsico de clulas grandes CD30+.

    Adems CD3 puede encontrarse en algunos casos de histiocitosis maligna y enfermedad de Hodgkin. CD45RO (UCHL-1), de la familia ALC, es la isoforma que identifica especialmente clulas T de memoria (CD45RA clulas T vrgenes). La ausencia de especificidad de los marcadores T se extiende al CD45RO (UCHL-1) que tambin puede ser expresado en linfomas B y celularidad mieloide normal y tumoral, aunque no en clulas NK.

    ¿Qué significa CD3?

    ¿Qué es CD3? – CD3 es una proteína que normalmente es producida por dos tipos de células inmunitarias especializadas: las células T y células NK. La mayoría linfomas que parten de las células T y NK, incluido el linfoma de células T periféricas, el linfoma anaplásico de células grandes y el linfoma de células NK/T, también producen CD3.

    ¿Qué expresan los linfocitos T?

    Los linfocitos T son parte del sistema inmunitario y se forman a partir de células madre en la médula ósea. Ayudan a proteger el cuerpo de las infecciones y a combatir el cáncer.