Que Hacen Los Linfocitos T Helper?

Que Hacen Los Linfocitos T Helper
Faith Izoduwa Uwadiae, Imperial College London, UK Traducción: Jesús Gil, Instituto de Biología Molecular, Mainz, Alemania Las células T cooperadores foliculares (Tfh, por sus siglas en inglés) son un grupo especializado de células T CD4+ inicialmente identificadas en las amígdalas humanas.

  1. Juegan un papel importante en la inmunidad protectora ayudando a las células B a producir anticuerpos frente a patógenos invasores.
  2. Se localizan en los órganos linfoides secundarios (OLSs), incluyendo las amígdalas, el bazo y los nódulos linfáticos.
  3. Estos órganos contienen numerosos linfocitos, separados en zonas definidas de células T y B.

Solo los Tfh se encuentran en la zona B y están en su mayor parte del tiempo en estrecho contacto con ellas. Aparte de los OLSs, también se pueden encontrar Tfh en la circulación.

¿Qué función tiene los linfocitos T helper?

Los linfocitos T son parte del sistema inmunitario y se forman a partir de células madre en la médula ósea. Ayudan a proteger el cuerpo de las infecciones y a combatir el cáncer. También se llama célula T y timocito.

¿Cómo se activan los linfocitos T helper?

Resumen La activación de los linfocitos T se inicia a través de la presentación de antígenos endógenos o exógenos por células presentadoras de antígenos a través del complejo mayor de histocompatibilidad, el cual se une a un receptor especializado presente en los linfocitos T.

  • Este reconocimiento desencadena una cascada de señalización intracelular que conlleva a un aumento en la expresión de integrinas, modificaciones del citoesqueleto y producción de factores de transcripción involucrados en la liberación de citocinas y mediadores inflamatorios.
  • Uno de los inductores más importantes en la activación celular es el complejo enzimático con acción tirosina cinasa.

Las cinasas que pertenecen a la familia SRC (SFK), FYN y LCK están involucradas en un gran número de procesos importantes en la activación, modulación de la respuesta linfocitaria y el desarrollo de enfermedades autoinmunes. La regulación de la señalización de las cinasas, así como de proteínas adaptadoras involucradas en la activación del linfocito T, son fundamentales para mantener el umbral de activación y modulación de la respuesta del linfocito.

  • La fosforilación de sitios de regulación positiva de estas proteínas es importante para permitir una configuración activa de la proteína y de esta forma su máxima capacidad como cinasa.
  • La fosforilación de los sitios de regulación negativa conlleva a una configuración cerrada de la proteína de tal forma que reduce su función de cinasa e inhibe su función.

Las alteraciones en la señalización por modificación de algunas proteínas citoplasmáticas se asocian en algunos casos al desarrollo de enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico. En condiciones fisiológicas, el complejo receptor de linfocitos T se reagrupa con complejos proteicos que interactúan armónicamente para generar una señal interna.

Los eventos de señalización alterados son en parte los responsables de una expresión anómala de citocinas, entre ellas la interleucina-6 (IL-6), IL-10, IL-2, IFN y CD40 ligando; estas modificaciones alteran la capacidad de los linfocitos T para sobre estimular a los linfocitos B, traduciéndose en un aumento en la producción de autoanticuerpos y en el desencadenamiento de la enfermedad autoinmune.

Palabras clave: Receptor de célula T Cinasa SRC específica de leucocitos Proto-oncogen FYN, familia de tirosina cinasas SRC Lupus eritematoso sistémico Proteína asociada a la cadena zeta del receptor de célula T Inmunorreceptor motivo de activación basada en tirosina Estabilizador de células T activadas Abstract The activation of T cells is initiated by the presentation of exogenous or endogenous antigens, by antigen presenting cells through the major histocompatibility complex, which binds to a special receptor on T cells.

  • This acknowledgement triggers a cascade of intracellular signalling that leads to an increase in integrin expression, cytoskeletal modifications, and transcription factors production involved in the liberation of cytokines and inflammatory mediators.
  • One of the most important inducers in cell activation is the enzymatic complex with tyrosine kinase action.

The kinases which belong to the SRC (SFK) LCK and FYN family have been involved in a large number of important processes in the activation and modulation of the T cells response, as well as in the development of autoimmune diseases. Regulating the kinases signalling, as well as the adapter proteins involved in T cell activation, is essential for maintaining an activation threshold, as well as the modulation of cell response.

  • The phosphorylation of the positive regulation sites of these proteins is important to allow an active configuration of the protein and thereby its maximum capacity as kinase.
  • The phosphorylation of negative regulation sites leads to a closed configuration of the protein that reduces its kinase function, and thereby inhibits its own function.

The alteration in signalling by the modification of certain cytoplasmic proteins in some cases is associated with the development of autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus. Under physiological conditions the T cell receptor complex regroups with protein complexes that interact harmonically to generate an internal signal.

The altered signalling events are partly responsible for an anomalous expression of cytokines, including the interleukin-6 (IL-6), IL-10, IL-2, IFN, and CD40 linking, these modifications affects the cells ability to over-stimulate T and B cells, resulting in an increased production of autoantibodies and the triggering of the autoimmune disease.

Keywords: T-cell receptor Leukocyte C-terminal Src kinase FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase Systemic lupus erythematosus Zeta-chain T-cell receptor Associated Protein kinase 70kda Immuno receptor tyrosine-based activation motif Linker for Activation of T cell Texto completo Introducción Los mecanismos de activación y regulación de linfocitos T involucran una cascada de eventos de señalización interna en las que gran número de proteínas tienen un papel relevante, induciendo en algunos casos fosforilación y activación de tirosina cinasas, lo que conlleva a la activación celular con liberación de citocinas y otros factores solubles.

Una alteración en las proteínas involucradas en los eventos de señalización puede dar como resultado la pérdida de su mecanismo efector, lo que significaría un cambio en la activación de la célula. Los cambios funcionales inducidos como consecuencia de estas alteraciones generan comportamientos diferentes en los linfocitos T y B, lo que produce, en algunos casos, sobreexpresión de proteínas inductoras y un aumento en la síntesis de anticuerpos.

En esta revisión se pretende incluir las proteínas y los marcadores más importantes involucrados en los eventos de señalización interna en linfocitos T, así como modificaciones en la expresión de algunas de ellas inducidas por mutaciones o por factores externos que desencadenan procesos autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES) ( tabla 1 ).

Activación fisiológica del linfocito T TCR, CD3 y receptores coestimuladores El T-cell receptor (TCR) es un heterodímero compuesto por una cadena alfa y una cadena beta que comparte similitud estructural con las inmunoglobulinas, teniendo un dominio variable y un dominio constante. Ambas cadenas se encuentran unidas a través de puentes disulfuro en un extremo cercano a la membrana celular.

El dominio variable está conformado por secuencias de aminoácidos codificados por segmentos de genes variable (V), diverso (D) y unión (J). El segmento D solo se encuentra en los segmentos que codifican para la cadena beta del receptor 1,2, Esta reorganización de segmentos en la región variable permite la formación de un sitio para el reconocimiento del antígeno.

  1. El TCR de los linfocitos T tiene la capacidad de reconocer péptidos que se encuentran unidos al complejo mayor de histocompatibilidad, expresado en la superficie de las células presentadoras de antígeno.
  2. Las cadenas alfa y beta del TCR tienen dominios citoplasmáticos cortos, que no participan en la señal intracelular debido a que no presentan sitios de fosforilación, se encuentran unidas a las cadenas del cluster of differentiation 3 (CD3), conformados por las cadenas heterodímeras CD3 δ¿, γ¿ y el homodímero ζζ del TCR 1,3–5,

Las cadenas alfa y beta del TCR pueden trasmitir la señal tras la unión de un péptido unido al complejo mayor de histocompatibilidad por medio de las cadenas CD3 al interactuar con las moléculas efectoras citoplasmáticas 1,6 ( fig.1 ). La unión del peptide major histocompatibility complex (pMHC) y el TCR genera una señal primaria que por sí sola no es capaz de generar la activación de los linfocitos, necesita de otras señales secundarias 7,8,

La unión de correceptores como el cluster of differentiation 4 (CD4), cluster of differentiation 28 (CD28), lymphocyte function associated antigen (LFA-1), cluster of differentiation 2 (CD2) con moléculas provenientes de las células presentadoras de antígeno genera una señal secundaria suficiente para la activación y modulación del umbral de respuesta 7–11,

Los trabajos de Tsokos et al. han evidenciado alteraciones en los eventos tempranos de las vías de transducción de señal en células T autorreactivas de pacientes con LES, haciendo énfasis en la vía de señalización dependiente de calcio. Los diseños experimentales en los que se utilizan anticuerpos monoclonales anti-CD3 para estimular linfocitos T han demostrado un aumento en la actividad de proteínas tirosina cinasas y en los niveles de calcio intracelular en linfocitos T autorreactivos de pacientes con LES, pero no en linfocitos T autorreactivos de pacientes con enfermedad mixta del tejido conectivo (EMTC) ni en linfocitos T de control 12,

  • Otros grupos han reportado otro tipo de alteraciones en las vías de señalización intracelular en células T de pacientes con LES, en la señalización interna a partir del reconocimiento antigénico por TCR y en la transducción de la señal en los linfocitos T.
  • La expresión de las cadenas ζ TCR está disminuida o ausente en la mayoría de las células T de los pacientes con LES, pero no en los que presentan otras enfermedades autoinmunes 13,

Esta anormalidad es específica de la enfermedad e independiente de la actividad y del tratamiento, por lo tanto, representa un defecto intrínseco potencial en la patogénesis del LES 14,15, Secuencias ITAM y función en la activación linfocitaria La unión entre el TCR y el pMHC genera la primera señal citoplasmática para la activación linfocitaria a través del correceptor CD3, por medio de sus cadenas citoplasmáticas con un patrón basado en tirosina y leucina que forma una secuencia consenso de «YxxI/Lx (6-8) YxxI/L» (repeticiones de tirosina y leucina cada 6 a 8 aminoácidos) 3,5,16,17,

  1. Esta secuencia patrón conocida como immuno receptor tyrosine-based activation motif (ITAM) es fosforilada en sus residuos de tirosina por cinasas, creando sitios específicos de unión para otras enzimas lo que permitirá transmitir y amplificar la señal 16,17,
  2. Las proteínas encargadas de la fosforilación de los residuos de tirosina en las secuencias ITAM hacen parte de las cinasas de la familia SRC (proto-oncogene tyrosine-protein kinase SRC) y las cinasas de la familia SFK (SRC family kinasas) 17–19,

Activación y regulación de las cinasas de la familia SRC, FYN y LCK Las cinasas de la familia SRC, FYN proto-oncogene, Src family tyrosine kinase (familia FYN) y leukocyte C-terminal Src kinase (familia LCK) están involucradas en un gran número de procesos relacionados con la activación y modulación de la respuesta linfocitaria.

Tanto FYN como LCK comparten dominios similares a otras cinasas de la familia de SRC, como las regiones homólogas SRC homology 3 (SRC3 o SH3 ), regiones homólogas SRC homology 2 (SRC2 o SH2), dominios tirosina cinasa SRC homology 1 (SH1), región N terminal de adición de ácidos grasos saturados y un dominio C terminal para la regulación negativa 20,21,

Las SFK son reguladas positivamente por la fosforilación de residuos de tirosina en su sitio catabólico, lo que promueve un cambio conformacional de la proteína y así su máxima actividad cinasa y su regulación negativa por la fosforilación de los residuos de tirosina en su región carboxiterminal predispone la conformación cerrada de la proteína y una disminución de su actividad cinasa 19,20,

  1. La cinasa LCK se encuentra unida al correceptor transmembranal CD4 por medio de enlaces no covalentes, cuando se da la interacción pHMC con el TCR, LCK es reclutada por su asociación con CD4 19,
  2. El correceptor CD4 se une al dominio invariable del pHMC facilitando el proceso de reconocimiento antigénico con el TCR y provocando la autofosforilación o transfosforilación de LCK en su región activa (Y394) 20,

Un regulador muy importante en la activación y la regulación de la actividad cinasa de LCK es CD45 7, El cluster of differentiation 45 (CD45) es una proteína transmembranal con 2 dominios citoplasmáticos, D1 y D2. El dominio 1 tiene actividad enzimática de fosfatasa y el dominio 2, aunque no se conoce del todo su función, puede estar involucrado en la regulación de los sustratos con los que interactúa D1 7,22,

  • El dominio 1 actúa en la desfosforilación del residuo de tirosina inhibitorio (Y505) en la región carboxiterminal de LCK permitiendo la completa actividad de cinasa 22,
  • Señalización citoplasmática del receptor de células T El reclutamiento del correceptor CD4 permite la proximidad de la cinasa LCK a sus sustratos en las cadenas del correceptor CD3; de esta forma, la fosforilación de los ITAM en sus residuos de tirosina.

La subunidad ζ del TCR modula la señal en el complejo TCR por su contribución de 6 ITAM por TCR 3,16, Tanto FYN como LCK tienen la posibilidad de fosforilar los residuos de tirosina de los ITAM, sin embargo, ambos tienen distinta distribución. LCK tiene mayor afinidad a los residuos de ITAM de la cadena CD3 y del TCR, mientras FYN participa en la interacción con mediadores del citoesqueleto especialmente focal adhesión kinase (FAK) 16,17,21,22,

¿Por qué hay tantos ITAM por complejo TCR? (10 por cada complejo); aunque no se conoce la respuesta exacta, se ha propuesto que esta cantidad de ITAM podría proveer la capacidad de amplificar la señal recibida por cada complejo TCR, aumentando la sensibilidad de la respuesta por la incorporación de 6 sitios específicos de fosforilación en las cadenas ζ del TCR y, adicionalmente, facilitar la expresión de citocinas 16,18,23–25,

Tampoco es claro el mecanismo exacto por el cual los residuos de ITAM son fosforilados, se piensa que el TCR al estar inactivo los residuos de tirosina, leucina e isoleucina se encuentran ocultos dentro de la región transmembrana del linfocito T y cuando el TCR es activado se genera un cambio estructural de las cadenas del CD3 permitiendo el descubrimiento de las secuencias para ser fosforiladas por las cinasas 3,19,

La fosforilación de 2 residuos de tirosina de las secuencias ITAM de las cadenas CD3 actúan como sitios de unión de alta afinidad a proteínas que contienen dominios SH2 en tándem, como lo son las proteínas zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kda (ZAP-70) y spleen tyrosine kinase (SYK) miembros de la familia de cinasas SYK 3,5,23,26,

ZAP-70 se une a los residuos de tirosina de ITAM que han sido fosforilados por LCK por medio de sus dominios SH2, quedando en cercanía a LCK para ser fosforilada en su residuo de tirosina (Y493); esto permite su activación como cinasa y así su autofosforilación (o transfosforilación) para desarrollar su máxima actividad 18,19,

Aunque la estructura y la función bioquímica de SYK y ZAP-70 son similares, hay una gran diferencia en su expresión; esto se debe al patrón de expresión de ZAP-70 que está restringido a linfocitos T y natural killer, mientras que SYK puede estar en linfocitos B, macrófagos, monocitos, mastocitos y plaquetas 21,

ZAP-70 activo, fosforila a linker for activation of T cell (LAT) y lymphocyte cytosolic protein 2 (SH2 domain containing leukocyte protein of 76kda) (SLP-76), que transmiten y diversifican la señal de activación 16 ( fig.1 ). Estabilizador de células T activadas signalosoma El signalosome es un complejo proteico que está compuesto por varios elementos de señalización que están asociados y regulados por la actividad de proteínas de andamiaje 27,

  • LAT es el ejemplo de esta clase de proteínas que recluta otras proteínas para formar un gran complejo proteico que facilita la señalización de los linfocitos T 19,
  • LAT es una proteína transmembranal cuya expresión se limita a células hematopoyéticas incluyendo linfocitos T, natural killers, plaquetas y mastocitos.

Está conformada por un dominio extracelular corto, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático largo que contiene residuos de tirosina 28, LAT carece de actividad enzimática y actúa como adaptador molecular para un gran número de proteínas, coordina el reclutamiento de intermediarios proteicos y de enzimas efectoras; sin embargo, LAT no es esencial en la activación de los linfocitos T, pero desempeña un papel más importante en la modulación de la activación linfocitaria por medio de la activación de proteínas que actúan en la regulación negativa de la respuesta 5,28,

  • LAT es rápidamente fosforilado por ZAP-70 tras la activación del TCR, generando múltiples sitios de alta afinidad para la unión de proteínas con dominios SH2.
  • Las proteínas adaptadoras de unión a LAT son conocidas como la familia de proteínas growth factor receptor bound protein 2 (GRB2), de las cuales hacen parte las proteínas GRB2, GRB2 related adapter protein (GRAP) y GRB2-related adaptor downstream of Shc (GADS).

Estos adaptadores comparten una estructura similar que consiste en 2 dominios SH3 y un dominio SH2. Por medio de sus dominios SH2 se unen a los residuos fosforilados de LAT y permiten la unión de otras proteínas por sus dominios SH3 expuestos 17,18, Estas proteínas unidas a LAT amplifican la señal de activación y, adicionalmente, la diversificación de las respuestas celulares tras la activación del linfocito T.

Cada proteína adaptadora asociada a LAT está involucrada en distintas vías de señalización, lo que permite la interacción con distintas proteínas efectoras. El adaptador proteico de LAT, GRB2 es punto de unión de múltiples proteínas gracias a sus dominios SH3, como la proteína son of sevenless (SOS).

GRAP, una vez unido a LAT, recluta a SOS, Dynamin y Src-Associated substrate in Mitosis of 68 kDa (SAM68) 17,18, GADS difiere de las otras proteínas adaptadoras de LAT por su distribución limitada a células hematopoyéticas y su dominio SH3 específico para la interacción con la proteína SLP-76 28,29,

SLP-76 es un adaptador multidominio proteico que está restringido a células hematopoyéticas incluyendo linfocitos T, monocitos/macrófagos, natural killers, mastocitos y plaquetas 28,30, Está conformada por una región rica en residuos de tirosina que son fosforilados por ZAP-70, una región central rica en prolina y una región carboxiterminal con un dominio SH2 que interactúa con una proteína adaptadora multidominio SLP-76 associated phosphoprotein/FYN binding protein (SLAP/FYB) 17,

ZAP-70 al fosforilar a SLP-76 en los residuos de tirosina sirve como sitio de unión a proteínas con dominios SH2 incluyendo Vav 1 guanine nucleotide exchange factor (VAV1), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1 (NCK) e IL2 inducible T cell kinase (ITK) 17,28,

  • Los estudios comparativos de proteínas ZAP-70, LAT y SLP-76 realizados por Januchowski et al.
  • En el 2007, en pacientes con LES y personas libres de la enfermedad, muestran un aumento significativo en la concentración de la proteína LAT en linfocitos T CD4+ de pacientes con LES, comparado con el grupo control, siendo aun mayor las concentraciones en las poblaciones activadas de linfocitos T CD4+ en comparación con las células vírgenes.

Esto indica una regulación al alza a nivel transcripcional de la proteína o una disminución en la degradación proteolítica de la proteína 31, Regulación del citoesqueleto de actina tras la activación del linfocito T La activación del linfocito T requiere la regulación de la organización del citoesqueleto de actina para facilitar la sinapsis inmunológica, permitiendo la comunicación con las células presentadoras de antígeno y facilitando distintos eventos que involucran: diferenciación a distintos linajes celulares, migración a través de los tejidos, adherencia celular, reorientación celular y secreción de mediadores celulares como citoquinas 32,

La reorganización del citoesqueleto va acompañada de un número importante de eventos de señalización interna. El complejo adaptador proteico multidominio SLP-76 es fosforilado por ZAP-70 permitiendo la interacción de proteínas especializadas en los arreglos del citoesqueleto como VAV1 y NCK. VAV1 es una proteína especializada en el intercambio de nucleótidos de guanina perteneciente a la familia Rho GTPasa.

La activación del SLP-76 por parte de ZAP-70 permite la unión de VAV1 a SLP-76 en sus dominios fosforilados y este a través de su dominio DH permite el intercambio de nucleótidos de GDP a GTP a las proteínas Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (RAC1) y cell división control protein 42 (CDC42), activándolas y regulando los cambios del citoesqueleto que se llevarán a cabo en la sinapsis inmunológica 33–38,

  1. Los dominios fosforilados de SLP-76 interactúan con NCK facilitando el reclutamiento de las proteínas Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP) y p21-activated kinase (PAK1) para los arreglos del citoesqueleto 33,39,
  2. PAK1 es miembro de la familia de cinasas Ser/Thr de las proteínas RAC1 y CDC42, y desempeña un papel importante en la organización del citoesqueleto y la activación de vías de señalización de estrés, como la cascada de señalización c-Jun N-terminal kinase (JNK) 33,

La configuración activa de CDC42 modula la proteína WASP y junto con WAS/WASL-interacting protein family member 1 (WIP) forma el complejo WIP-WASP fundamental para la regulación de actin related proteins 2/3 (ARP 2/3) 36,40, La configuración activa de RAC1 activa a la vez la proteína WASP-family verprolin-homologous protein (WAVE2) formando el complejo RAC1-WAVE2 que activa el complejo ARP2/3.

  • El complejo ARP2/3 interactúa con los monómeros de actina para su polimerización y así facilita la organización del citoesqueleto para la sinapsis inmunológica 33,34,36 ( fig.1 ).
  • WASP es reconocida por el síndrome Wiskott-Aldrich, una inmunodeficiencia de herencia ligada al cromosoma X que resulta de la mutación del gen WASP, específicamente una mutación en el dominio WH1, una región que es requerida para la estabilización proteica a través de la asociación con WIP, al no existir esta interacción se degrada WASP 41,

La estructura del TCR está alterada en la mayoría de pacientes con LES, la cadena ζ TCR es reemplazada por la cadena γ del Fc¿R, lo que contribuye a anormalidades en la señalización 42, La señalización a través del TCR alterado en el LES se presume que es mucho más fuerte debido a la asociación que hay entre FcR γ, que es 100 veces más potente que la señalización por ZAP-70 43,

Los estudios de Tsokos mostraron diferentes asociaciones moleculares entre la interacción de SYK con FcR γ desencadenantes de la señalización del TCR en pacientes con LES, encontrando: 1) aumento en la expresión de SYK pero no de ZAP-70; 2) mayor asociación de SYK con el citoesqueleto de actina comparado con ZAP-70; 3) inhibición de SYK normalizando la cinética de la polimerización de actina, y 4) diferencias entre SYK y ZAP-70, en sus patrones de asociación con moléculas de señalización claves, lo cual generan diferentes perfiles de señalización inducidos por el TCR 43,

Señalizaciones efectoras del linfocito T La unión del TCR con el péptido unido al MHC inicia una serie de eventos de señalización que preparan al linfocito para la diferenciación celular, la proliferación y la función efectora. Las vías de señalización que conllevan a la activación del nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB), el factor activator protein 1 (AP-1) y nuclear factor of activated T-cells (NFAT), son cruciales para la expresión de moléculas efectoras requeridas para la función de los linfocitos.

  1. Señalización ERK-c-Fos La cascada de mitogen activated protein kinase (MAPK) es una forma de señalización para procesos celulares como diferenciación, crecimiento celular, proliferación, movilidad y respuesta al estrés.
  2. La señalización se desarrolla gracias a un núcleo de 3 cinasas (MAP3K, MAPKK y MAPK) que permiten la activación de componentes efectores ( MAP kinase activated protein kinase (MAPK-APK) 44,

La cascada se propaga gracias a la activación en secuencia de las cinasas permitiendo la fosforilación de componentes reguladores. La señalización de extracellular-signal-regulated kinases (ERK1/2) inicia tras la fosforilación de LAT y la unión de las proteínas GRB2 y GADS, que actúan como adaptadores para el reclutamiento a la membrana del intercambiador de nucleótidos SOS para la activación de RAS 7,45,46,

RAS unido al GTP recluta y activa la primera cinasa RAF-1 (MAP3K), esta activa MEK1/2 (MAPKK) permitiendo la transmisión de la señalización a las cinasas ERK1/2 (MAPK). La señalización continúa en los complejos MAPK-APK o en otros sustratos que se encuentran tanto en el citoplasma como en el núcleo; sin embargo, la fosforilación de ERK1/2 del factor nuclear c-Fos es importante para impedir su degradación 44 ( fig.2 ).

Señalización JNK-c-Jun La cascada JNK, también llamada cascada inducida por estrés (stress-activated protein kinase cascade ) 44, involucra diferentes vías de señalización encargadas de la respuesta celular a estímulos de estrés. El estímulo de estrés es percibido por la célula y la señalización se transmite hasta las GTPasas CDC42 y RAC1, que van a activar la señalización MAPK, ya sea directamente sobre las cinasas MEKK2 (MAP3K) o indirectamente por medio de las cinasas MAP4K, que a la vez activan a las cinasas MAP3K 47,

  • La activación de MAP3K transmite la señal a través de la fosforilación a MKK4/7 (MAPKK), activando las cinasas JNK1/2/3 (MAPK).
  • Las 3 isoformas de JNK tienen como función la fosforilación de c-Jun inhibiendo su degradación y permitiendo la interacción con otros factores transcripcionales 47,
  • La activación del factor c-Fos junto con la activación del factor c-Jun forman el factor AP-1, un factor heterodimérico que interactúa con NFAT para la síntesis de interleucina (IL)-2 y está involucrado en la supervivencia celular 48 ( fig.2 ).

Los estudios sobre alteraciones en las vías de señalización en linfocitos T de pacientes con LES han mostrado defectos en la activación de la cascada MAP cinasa en respuesta a la señalización dada por el complejo TCR/CD3. Los defectos están relacionados con activación del complejo RAS/RAF y disminución de la translocación del complejo nuclear AP-1; de igual forma, se ha demostrado una disminución en la unión de SOS a GRB2 en linfocitos T de pacientes con LES 49,

La actividad MAP cinasa defectuosa puede alterar la coordinación de las señales necesarias para la producción normal de IL-2 y el mantenimiento de la tolerancia en los linfocitos T de pacientes con enfermedad autoinmune. Señalización de la fosfolipasa C y el factor nuclear de células T activadas La enzima ITK hace parte de la familia de tirosina cinasas tecprotein tyrosine kinase (TEC), entre los dominios de ITK se encuentran los dominios SH2 y SH3 para las interacciones proteicas y el dominio pleckstrin-homology domain (PH) de unión al PtdIns (3,4,5) P3 (phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate), siendo este necesario para su activación 36,50,

La activación de ITK requiere varios pasos relacionados, el primero es el reclutamiento y la unión de la proteína ITK a la membrana celular por medio de su dominio PH al PtdIns (3,4,5) P3. El PtdIns (3,4,5) P3 es producto de la fosforilación de PtdIns (4,5) P2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate) por la cinasa phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), las fosfatasas phosphatase and tensin homologue (PTEN) y SH2-domain-containing inositol-5-phospatase (SHIP) regulan la rotura del fosfato del PtdIns (3,4,5) P3 para formar PtdIns (4,5) P2, regulando así la señal del linfocito 50–54,

El segundo paso es la presencia de una cinasa de la familia SRC para la fosforilación del complejo ITK-PtdIns (3,4,5) para su activación. Dentro de la familia SRC que interactúa con ITK se encuentra la cinasa LCK, la cual es necesaria para su activación 55, El tercer paso consiste en la interacción de ITK con proteínas involucradas en la señalización del TCR como el complejo LAT-GADS-SLP-76 52,55,

La activación de la enzima ITK permite la amplificación y la diversificación de la señal por medio de la fosforilación y la activación de la enzima phosphoinositol phospholipase C gamma 1 (PLCγ1). PLCγ1 regula el metabolismo de los fosfolípidos de inositol por medio de la hidrólisis del PtdIns (4,5) P2 para la formación de i nositol 1,4,5- triphosphate (InsP3) y diacilglicerol (DAG).

Existen 2 formas de la proteína, PLCγ1 y PLCγ2, predominando la forma PLCγ1 en los linfocitos T 56,57 ( fig.3 ). El diacilglicerol activa protein kinase C theta (PKCθ), que es una serina/cinasa miembro de la subfamilia de las PKC independientes de calcio, cuya expresión está limitada a linfocitos T, células musculares y plaquetas 58,

Se ha demostrado en estudios in vitro con células T Jurkat que LCK fosforila a PKC-θ en su dominio C2, que es un dominio de tirosina (Y90); sin embargo, no se ha demostrado que esta fosforilación esté involucrada en cambios con la actividad enzimática ni en su regulación, pero mutaciones en la tirosina 90 (cambio de tirosina a fenilalanina) han demostrado alteraciones en la activación de NFAT y AP-1 59,

  • Una vez se activa PLCy1 y hay liberación de DAG, el DAG se une al dominio C1 de PKC-θ, cambiando su conformación a un estado abierto de su sitio activo permitiendo la fosforilación de sus sustratos 58,
  • PKC-θ está involucrado en la activación de 2 factores de transcripción importantes para la activación del gen IL-2, que son AP-1 y NFκB.

La activación del factor de transcripción AP-1 por PKC-θ se logra a través de la interacción con Ste20/SPS1 related proline and alanine rich kinase (SPAK), una cinasa de la familia Ste-20 involucrada en la señalización MAP cinasa 60, La activación de NFκB puede ser inducida por la fosforilación de CARD11/CARMA ( caspase recruitment domain-containing protein 11) por PKC-θ, liberando el complejo IκB kinase (IKK) que interactúa en la degradación mediada por ubiquitinación de inhibitor of kappa B (IκB), liberando de esta forma NFκB para su translocación al núcleo 61,

  • La translocación de NFκB al núcleo permite la transcripción de genes involucrados en la expresión de citocinas proinflamatorias, expresión de moléculas citotóxicas, proteínas inhibidoras de la apoptosis y la expresión de genes involucrados en la proliferación celular.
  • El DAG actúa en la estimulación de la vía MAPK/ERK, junto a JNK activan el factor AP-1.

El calcio y el DAG regulan positivamente la translocación de la proteína RAS guanyl releasing protein 1 (RASGRP1) de la membrana del aparato de Golgi 19,62, RASGRP1 realiza el cambio de GDP a GTP para la activación de la señalización MAPK/ERK por medio de RAS 62,63 ( fig.3 ).

  1. La regulación del calcio está mediada por canales ubicados tanto en el retículo endoplasmático como en la membrana celular.
  2. La activación del TCR eleva rápidamente las concentraciones de InsP3 acoplándose al receptor InsP3R.
  3. Ins (1,4,5) P3 receptor es una glucoproteína unida a la membrana del retículo endoplasmático que actúa como canal de calcio que libera el calcio almacenado dentro del retículo al citoplasma, aumentando las concentraciones dentro de la célula 51,64,65,

Sin embargo, el calcio liberado del retículo endoplasmático no es suficiente para estimular a las proteínas dependientes de calcio, es por ello que es necesaria su liberación por otras vías como la activación de canales transmembrana. La pérdida de calcio dentro del retículo endoplasmático es censada por las proteínas STIM1 o STIM2 (stromal interaction molecule).

  1. Las proteínas STIM son proteínas transmembrana ubicadas en el retículo endoplasmático que actúan como sensores de los niveles de calcio manteniendo la homeostasis dentro de la célula 66,
  2. La porción N-terminal de las proteínas STIM está ubicada en la luz del retículo y posee dominios especializados para censar pequeños cambios en la concentración de calcio dentro del retículo.

Una vez se censan las bajas concentraciones de calcio, se genera un cambio de un estado dimérico basal a un estado oligomérico, el cual migra a la membrana plasmática y es capaz de desencadenar la entrada de calcio hacia la célula a través de canales calcio transmembrana ORAI (calcium release-activated calcium modulator 1) por dominios ubicados en su región C-terminal citoplasmática 66,67,

El calcio dentro de la célula actúa como un segundo mensajero para la activación de NFAT. Las concentraciones elevadas de calcio dentro de la célula son cruciales para la activación del sensor intracelular sensible a calcio, calmodulina 26, Normalmente, sin la presencia de calcio, la proteína permanece en un estado inactivo o «cerrado» y cuando hay un aumento de las concentraciones de calcio, el calcio se une a la calmodulina y sufre un cambio conformacional a un estado «abierto», permitiendo su unión a la enzima calcineurina 68,

La calcineurina es una proteína serina/fosfatasa calcio-calmodulina dependiente que defosforila múltiples regiones de NFAT, incluyendo su dominio de reconocimiento al ADN, de esta forma permitiendo la translocación del factor de transcripción al núcleo 7,69,70 ( fig.3 ).

Se ha demostrado el papel de NFAT en la transcripción de un gran número de citocinas involucradas en la respuesta efectora del linfocito T, como IL-2, IL-4, IL-10, IFN-gamma, el factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), y TNF. También se ha demostrado el papel que desempeña NFAT en la expresión de IL-5 como en la expresión de CD40L y CD95L en linfocitos T de pacientes con LES 70,

El calcio como segundo mensajero de múltiples vías de señalización es estrechamente regulado para garantizar una óptima respuesta celular ante un estímulo; alteraciones en su concentración implican señalizaciones anómalas que tienen implicaciones en la respuesta celular.

  • Las altas concentraciones de calcio resultan en un aumento de la expresión de ligandos celulares, como lo son el ligando CD40 (CD40L) y Fas ligando (FasL) 12,
  • Estudios realizados por Tsokos et al.
  • Han demostrado que los linfocitos T de pacientes con LES expresan altas cantidades de FasL sobre su superficie, comparados con los grupos controles, dando explicación de las altas tasas de apoptosis que se evidencian en linfocitos de pacientes con enfermedad autoinmune 71,

Se evidenció además un aumento en la expresión del CD40L sobre la superficie celular de los linfocitos T y un aumento de la expresión de CD40 sobre la superficie de linfocitos B en pacientes con LES, así aumentando la interacción CD40-CD40L, que da lugar a un aumento de la estimulación de linfocitos B y producción de anticuerpos con consecuencias inmunológicas importantes 72,

Señalización correceptor CD28 La señal que se genera por la activación del TCR por sí sola falla en desencadenar una activación completa del linfocito; es necesaria la presencia de correceptores que proporcionen señales adicionales por medio de vías de señalización en común con la señal principal para que se garantice una señal suficientemente fuerte para la activación del linfocito T.

El correceptor CD28 tiene gran importancia en la activación celular por su participación en la generación de señales coestimuladoras. Es una glucoproteína transmembrana que se expresa principalmente en linfocitos T activados y en reposo 9, Se une a los ligandos CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) correceptores de las células presentadoras de antígenos, por lo tanto, está involucrada en procesos de proliferación, evita procesos de anergia, facilita la expresión de citoquinas y media la supervivencia celular 73 ( fig.4 ).

  • Los aminoácidos que comprenden la cola citoplasmática del correceptor CD28 poseen actividad enzimática intrínseca.
  • Esta cola citoplasmática posee 4 tirosinas que son clave para la señalización intracelular; son fosforiladas por FYN o por LCK.
  • La fosforilación del residuo de tirosina 170 (Y170) que se encuentra ubicada en la secuencia patrón altamente conservada TYR-MET-ASN-MET (YMNM) permite el reclutamiento de proteínas con dominios SH2 como PI3K y GRB2 73–75 ( fig.4 ).
See also:  Que Son Los Linfocitos Lth Y Ltc?

PI3K forma parte de la familia de enzimas que regulan la función biológica por medio de la generación de lípidos como segundos mensajeros. Esta se divide en distintas clases de acuerdo con su función; las PI3K clase I predomina principalmente en los linfocitos.

  • A su vez, las PI3K se divide en 2 grupos, de acuerdo con su activación, siendo el grupo IA activado por receptores asociados a tirosina cinasas, correceptores y receptores de citocinas 74,
  • PI3K IA consta de 2 subunidades, la subunidad P85, que es la subunidad reguladora, se une a la secuencia patrón YMNM del correceptor CD28 para su activación; la subunidad P110, que es el complejo catabólico, actúa en la fosforilación del PtdIns (4,5) P2 a PtdIns (3,4,5) P3 74,76,

Este lípido actúa en moléculas que contengan dominios PH, como AKT/PKB e ITK. AKT/PKB (protein kinase B) está relacionada en la regulación de numerosas vías de señalización que promueven el crecimiento celular, la progresión en el ciclo celular y la supervivencia 77,78 ( fig.4 ).

  1. Se ha demostrado que sin la segunda señal coestimuladora, los linfocitos T fallan en la producción de IL-2 y establece un estado de anergia 79,80,
  2. Aunque la señalización mediada por CD28 en linfocitos T en pacientes con lupus se encuentra intacta, el ligando CD80 se encuentra disminuido conllevando a una deficiencia en la señalización mediada por CD28 y, por ende, en la disminución en la producción de IL-2 81,

Balsas lipídicas Las balsas lipídicas son microdominios en la membrana celular compuestos por lípidos diferentes de los que hacen parte normalmente la membrana celular, entre estos lípidos se encuentran los glucoesfingolípidos, esfingomielina, colesterol, entre otros.

  1. Estas balsas lipídicas crean un ambiente que permite acumular o segregar diferentes proteínas a una región específica 82,
  2. Los esfingolípidos tienen un punto de ebullición alto, lo que les permite formar conjuntos ordenados separados de la capa de fosfolípidos que tienen un punto de ebullición más bajo; el colesterol se mezcla preferentemente entre los esfingolípidos para estabilizar la estructura de la membrana y su fluidez.

Por lo tanto, las balsas lipídicas pueden actuar como plataformas que se mueven libremente en la membrana celular 83, La complejidad del ambiente de las balsas lipídicas permite una regulación temporo-espacial de la regulación de la señal del linfocito T.

  • Varias proteínas, como LAT, CD4 y LCK, se encuentran en las balsas lipídicas gracias a interacciones entre lípidos-lípidos o lípidos proteínas.
  • La adición de grupos saturados a las proteínas con dominios intracelulares, extracelulares o transmembrana aumenta la afinidad de estas proteínas al ambiente organizado de las balsas lipídicas.

LCK es modificado con la presencia de grupos de lípidos saturados y su presencia en las balsas lipídicas es requerida para la transducción de la señal a través de la activación del TCR 84, LAT que también es modificado por la adición de estos grupos de lípidos saturados, una vez se activa el TCR hay un reclutamiento de proteínas propias de la señalización a las balsas lipídicas lo cual facilita la transducción de la señal 83,84,

Regulación de la activación del linfocito Co-receptor CTLA-4 Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) es un correceptor que tiene un papel fundamental en la regulación negativa de la señal de activación del linfocito T; es una glucoproteína que comparte gran similitud con CD28 y, al igual que este, posee dominios extracelulares similares a las de las inmunoglobulinas.

La expresión del correceptor CTLA-4 está restringida a linfocitos T, ya sean CD4 o CD8; sin embargo, no se expresa en linfocitos T vírgenes, pero se expresa en la membrana una vez el linfocito T está activado 85,86, Los ligandos de unión del CTLA-4 son CD80/86, ubicados en la membrana de la célula presentadora de antígenos.

Se ha demostrado que la unión de CTLA-4 a sus ligandos CD80/86 es mucho más afín que la unión de CD28 a estos mismos 85, La razón por la cual tanto CTLA-4 como CD28 comparten los mismos ligandos indica la presencia de una señal coestimuladora necesaria para la activación del linfocito T generada por la unión de CD28 y su ligando, y en contraste una señal reguladora que module la activación del linfocito generada por la unión de CTLA-4 a su ligando; de esta forma, mantiene un balance entre la señal de activación y la señal moduladora.

CTLA-4 inhibe la activación linfocitaria por medio de la reducción de la producción de IL-2 y la disminución en la expresión del receptor para IL-2, deteniendo el ciclo celular en fase G1 87, CTLA-4 se ubica en el citoplasma, en vesículas citoplasmáticas y su expresión a la superficie de las células se da por mecanismos regulados por clatrina, limitando de esta forma la unión de los ligandos CD80/86, previniendo la terminación prematura de la respuesta inmune.

  1. CTLA-4 posee una cola citoplasmática sin actividad enzimática intrínseca compuesta por secuencias patrón característico YVKM y 2 residuos de tirosina involucrados en la actividad y regulación de esta proteína (Y201, Y218).
  2. En su forma no fosforilada, el patrón Y201VKM del CTLA-4 se asocia a la subunidad AP50 del complejo proteico asociado a clatrina, lo cual determina el estado citoplasmático de la proteína.

Múltiples proteínas con actividad cinasa actúan sobre el residuo crítico de tirosina del CTLA-4 (Y201), entre ellos los más importantes LCK y FYN 88,89, La fosforilación de este residuo hace una translocación de las vesículas citoplasmáticas a la membrana celular permitiendo la interacción de CTLA-4 con su ligando y así modular la señalización del TCR inhibiendo la unión de AP-1 y NFAT al núcleo, y suprimiendo las vías de señalización de ERK y JNK.

  1. CTLA-4 actúa por medio de fosfatasas que actúan directamente sobre sustratos específicos, sin embargo, la señalización de CTL-4 en cuanto a cómo ejerce su efecto inhibitorio ha sido bastante discutida e inclusive contradictoria 90,
  2. Ubiquitinación y degradación La ubiquitinación es el proceso por el cual las células pueden discriminar proteínas que van a ser degradadas, esto se lleva a cabo gracias a la marcación de la proteína con ubiquitina, lo cual permite su degradación.

La ubiquitina es un péptido de 76 aminoácidos; se une a proteínas a través de 3 enzimas, E1, E2 y E3 por el proceso de ubiquitinación. El primer paso de la ubiquitinación consiste en la formación de un enlace tioéster con el residuo de glicina del C-terminal de la ubiquitina y el grupo sulfhídrico (o tiol) de la cisteína de E1 en su centro activo.

  • El segundo paso consiste en la transferencia de la ubiquitina desde una enzima E1 a una enzima E2 de conjugación (Ubc).
  • El paso final consiste en la unión de la E2-ubiquitina a una E3 ligasa; esta cataliza la formación de un enlace isopeptídico entre la glicina del C-terminal de la ubiquitina con la lisina del sustrato específico 91,

Las enzimas E3 tienen la función tanto de reconocimiento de la proteína específica, a la cual será llevada a la ubiquitinación, así como la capacidad de interactuar con las enzimas E2. Las proteínas marcadas en su lisina 48 poliubiquitinadas son sustrato de degradación proteica por medio del proteasoma 26S 91,92,

  • La familia de proteínas Casitas B-lineage lymphoma (Cbl) son proteínas adaptadoras moleculares, se unen a proteínas para su ubiquitinación y su degradación.
  • En mamíferos se encuentran 3 genes que codifican para las proteínas de la familia Cbl: c-cbl, cbl-b y cbl-3 (o también conocida como cbl-c ) 92–95,

La estructura de las proteínas Cbl es similar entre ella, contiene un dominio de unión a tirosina cinasa o dominio tirosine kinase binding domain (TKB), un dominio really interesting new gene (RING) responsable de la función catalítica de las ligasas E3, una región rica en prolina (propias de las proteínas c-Cbl y Cbl-b) y un dominio C-terminal de asociación a ubiquitina o ubiquitin associated (UBA) 93,94,

En linfocitos T las proteínas c-Cbl y Cbl-b están encargadas del control de la señalización generada por la activación del TCR, esto por medio de la ubiquitinación de receptores activos y receptores asociados a tirosina cinasa. C-Cbl forma un complejo con la cadena zeta del TCR y ZAP-70 para promover la ubiquitinación de la cadena zeta y su degradación 92,95,96,

Se ha reportado que c-Cbl puede regular negativamente la función de ZAP-70 independiente de la proteólisis 92, C-Cbl también interactúa con el dominio SH2 de la subunidad p85 de la enzima PI3K y de esta forma regula negativamente la señal de PI3K de coestimulador de la señalización del linfocito T 97,

Estudios se han enfocado en la relación existente entre Cbl-b y VAV1, aunque no se ha demostrado que Cbl-b esté involucrada en la degradación de VAV1, pero sí en el control de los sustratos de fosforilación tras la activación del TCR y la señal de coestimulación de CD28 para la activación de VAV1 34,94,98,

La importancia de la acción antagónica de Cbl-b hacia PKC-θ es por la modulación del umbral de respuesta del linfocito T, por lo tanto, Cbl-b regula a PKC-θ a través de la regulación negativa de la señalización de VAV1 y PI3K, lo cual puede controlar la transcripción de IL-2 en ausencia de la coestimulación de CD28 98,99,

Sin embargo, estudios recientes han demostrado que PKC-θ es un regulador de la acción del Cbl-b; por medio de la coestimulación del receptor CD28 es posible su destrucción 100 ( fig.5 ). Inhibición de la familia de cinasas SRC (SFK) por medio del complejo PAG/CSK La regulación de la activación de las cinasas involucradas en la activación del linfocito T es fundamental para mantener un umbral de activación.

Las enzimas C-terminal SRC kinase (CSK) son cinasas citoplasmáticas que fosforilan regiones involucradas en la regulación negativa de la familia de cinasas SRC. Es importante la proximidad de CSK a su sustrato y esto se logra gracias a su interacción con la proteína phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomain (PAG) 101,

PAG, o también conocida como Csk-binding protein (CBP) es una proteína transmembrana ubicua con múltiples residuos de tirosina, que al ser fosforilados actúan como bolsillos de unión para proteínas que contengan dominios SH2; adicionalmente, posee 2 secuencias ricas en prolina que permiten la interacción con proteínas que contengan dominios SH3 101,102,

La característica de PAG en linfocitos T, a diferencia de las otras células, es su máximo punto de fosforilación cuando la célula se encuentra en reposo (en células diferentes de linfocitos T la unión de receptores de membrana con sus ligandos estimula la activación de PAG).

Cuando la célula se encuentra inactiva, la fosforilación de PAG es mediada por la familia de cinasas SRC, específicamente por FYN 101,103, El reclutamiento de CSK requiere la fosforilación de un sustrato de tirosina específico (Y317) de PAG, lo cual permite la unión de CSK a PAG por medio de su domino SH2; la unión de CSK a PAG no solo permite la proximidad de CSK a la membrana plasmática y, por ende, a su sustrato, si no que permite un cambio conformacional de la proteína y de este modo aumenta la actividad catalítica de la enzima 104,

Una vez CSK se encuentra en cercanía a LCK la fosforila en un sustrato de tirosina específico (Y505) permitiendo un cambio conformacional de la proteína a un estado cerrado y, por ende, sin actividad de cinasa. Cuando se da la activación del linfocito T, PAG es rápidamente desfosforilado resultando en la liberación de CSK de la membrana y este es secuestrado en el citoplasma por Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 (G3BP); esto permite que se encuentre lejos de la sinapsis inmunológica 104,105,

  • Las enzimas candidatas de desfosforilar a PAG son CD45 o tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 (PTPN 11) 104,106 ( fig.5 ).
  • Docking protein 1 (DOK1/2) son adaptadores moleculares citoplasmáticos que están relacionados con la regulación negativa de la señal del TCR.
  • DOK1/2 se unen a LAT junto con Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 5-phosphatase 1 (SHIP1).

SHIP1 hidroliza el fosfolípido del PtdIns (3,4,5) P3 para producir PtdIns (3,4) P2 y así regular la señal por medio de la interferencia del reclutamiento de proteínas que contengan el dominio PH como la proteína AKT o ITK 53,107, DOK1/2 puede estar asociado con los ITAM fosforilados de las cadenas ζ y ¿, desplazando la unión de ZAP-70 a estas.

  1. También se ha demostrado que DOK1/2 contienen secuencias para los dominios SH2 y SH3, por lo cual se puede asociar a Ras GTPase activating protein (RASGAP) 107,
  2. RASGAP es un atenuador de la activación de la proteína RAS, por lo que disminuye la señalización MAPK/ERK 108,
  3. La unión de CSK a través de sus dominios SH2 a DOK1/2 puede estar involucrada en el reclutamiento para la inhibición de LCK 107 ( fig.5 ).

Regulación negativa mediada por fosfatasas PTPN22 Las fosfatasas de las tirosina cinasas (PTP) tienen un papel esencial, tanto en el mantenimiento del fenotipo activado de los linfocitos T, así como en la reversión del estado activado a un estado de reposo cuando termina la respuesta inmunitaria 106,

Cada PTP está formado por un dominio catalítico que posee preferencia al sustrato específico y dominios no catalíticos que están involucrados en la regulación de la actividad de fosfatasa. Dentro de los reguladores de la señal de activación se encuentra el producto del gen PTPN22, lymphoid-tyrosine phosphatase (LYP) expresado en humanos y su ortólogo murino PEP 109,

LYP/PEP es una fosfatasa de tirosina con expresión restringida a células hematopoyéticas, esta contiene un dominio de fosfatasa en su región N terminal, una región rica en prolinas y una región C-terminal altamente conservada entre su familia de fosfatasas llamado grupo PEST-PEP, un potente regulador negativo de la señal del TCR 109,

PEP actúa desfosforilando los residuos reguladores positivos de las proteínas FYN (Y417), LCK (Y394) y ZAP-70. Esta regulación negativa es posible gracias a su interacción con el dominio SH3 de la proteína CSK por sus secuencias patrón ricas en prolina 110, mientras PEP desfosforila las tirosinas de las regiones reguladoras positivas de proteínas de la familia SRC, CSK fosforila las regiones reguladoras negativas de estas.

Alteraciones en el regulador de la señalización linfocitaria PTPN22 se han relacionado con múltiples enfermedades autoinmunes, incluyendo LES, artritis reumatoide, artritis juvenil idiopática, enfermedad autoinmune tiroidea, granulomatosis de Wegener, miastenia gravis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, esclerosis sistémica, entre otras enfermedades 109–111,

  1. Dentro de los estudios de la activación y transducción de la señal a través del TCR, se ha documentado el polimorfismo del gen PTPN22 (rs2476601; 1858 C → T) y su relación con el LES.
  2. Este polimorfismo se caracteriza por la sustitución del aminoácido arginina por un triptófano en la posición 620 de secuencia de aminoácidos.

Este cambio ocurre en la región proximal rica en prolina dominio de unión a SH3 del PTPN22. Esta porción rica en prolina es un importante sitio de unión para el dominio C-terminal de CSK, por lo cual este polimorfismo interrumpe la interacción entre PTPN22 y CSK; de esta forma, la supresión de la activación del linfocito T no se lleva a lugar.

El efecto neto de este polimorfismo en la interacción entre PTPN22 y CSK para la generación de enfermedad autoinmune es tema de controversia y los mecanismos de acción propuestos están basados en modelos animales. Una explicación del papel del polimorfismo Trp620 en la patogénesis de la enfermedad autoinmune es la alteración en el balance de los linfocitos T efectores y los linfocitos T reguladores.

Se sugiere que el balance entre los linfocitos T efectores promotores de enfermedad autoinmune y linfocitos T reguladores protectores es finamente regulado por la expresión o actividad de PTPN22 111,112, Alteraciones de las señales de activación de las células T en LES El lupus eritematoso es un desorden autoinmune sistémico, crónico, potencialmente fatal.

  • Los defectos pueden ocurrir en varias partes de la cascada inmune, resultando en presentaciones clínicas heterogéneas.
  • A continuación, se describirán múltiples vías de señalización implicadas en la inmunopatogenia de la enfermedad.
  • Alteraciones en CD3 La mayoría de los pacientes con LES tienen defectos en la expresión de las cadenas ζ del TCR, así como alteraciones en la fosforilación de estas.

Las deficiencias en la fosforilación de las cadenas ζ del TCR tras la activación linfocitaria se ha observado en más del 78% de pacientes con lupus. Se han descrito múltiples mecanismos potenciales para explicar la disminución en la expresión 113, Estudios realizados por Tsuzaka et al.

  1. Para investigar los mecanismos moleculares de la expresión reducida de las cadenas ζ del TCR aislaron el mRNA de las cadenas ζ en linfocitos T periféricos de 8 pacientes con LES.
  2. Por una parte, encontraron que 2 pacientes presentaron deleciones del exón 7 del mRNA de la cadena ζ; por otra parte, 6 pacientes presentaron mutaciones puntuales en el sitio de unión del GTP/GDP en el dominio 3 de ITAM que se acompañan de sustituciones de aminoácidos en el dominio 3 del ITAM 114,

Se reconocen 3 dominios importantes del ITAM que al ser fosforilados son sitio de unión para proteínas tales como ZAP-70, actina, PI3K o Shk. Mutaciones de una o 2 tirosinas dentro del ITAM o que no se produzca la fosforilación, o solo monofosforilación, conlleva a alteraciones en la transducción de la señal.

  • De esta observación es posible determinar que el mRNA aberrante del TCR es responsable de la disminución de la fosforilación y disfunción de la señal del TCR 115,
  • La región no traducida 3′ de la cadena ζ del TCR (3′-UTR – unstranslate región 3′) ha demostrado que cumple un papel importante a nivel postranscripcional.

El mRNA 3′-UTR tiene secuencias reguladoras en cis como lo son las secuencias ricas de adenosina-uridina que se unen a proteínas reguladoras trans y están implicadas tanto en la estabilización o desestabilización del transcrito. Análisis en el mRNA de las cadenas ζ han encontrado empalmes alternativos con pérdida de exones, así como inserciones en el transcrito 115,

  1. En el estudio de Chowdhury et al., determinaron que el mRNA de la cadena ζ del TCR presentaban un nuevo empalme alternativo con deleción de nucleótidos desde 672 a 1233 del exón viii de las cadenas ζ del mRNA.
  2. Este empalme (ζcDNA/AS-3’UTR) de 344 pb está expresado predominantemente en linfocitos T de pacientes con lupus comparado con controles sanos.

Esta secuencia corta de 3′-URT es menos estable que la versión natural del mRNA; adicionalmente, tiene un mayor nivel de degradación en linfocitos T de pacientes con lupus, indicando que los linfocitos T de pacientes con lupus tienen factores adicionales que promueven la degradación de las cadenas cortas del empalme alternativo.

Los resultados demuestran que la presencia de elementos reguladores en la región eliminada del empalme de 562 pb es requerida para la apropiada y eficiente traducción del mRNA 116, Adicionalmente, la producción de esta cadena de empalme alternativo representa un mecanismo molecular que contribuye a la expresión disminuida de las cadenas ζ del TCR en pacientes con LES.

El Fc¿ receptor type I γ chain (Fc¿RIγ) es un miembro de la familia de proteínas de la cadena ζ, también es un componente de la región de los receptores de IgE de alta afinidad; contiene un ITAM citoplasmático que, a diferencia de la cadena ζ del CD3, media la señalización a través de la proteína cinasa SYK 117,

  • Como se mencionó previamente, SYK cinasa es 100 veces más potente que ZAP-70 y preferiblemente reclutada por Fc¿RIγ; de esta forma, al haber una disminución de las cadenas ζ del TCR hay un reemplazo por Fc¿RIγ; esto aumenta la actividad de SYK.
  • La cinasa SYK es una proteína capaz de fosforilar ITAM independientemente de la actividad de SFK, a diferencia de ZAP-70, activando múltiples vías de señalización por medio de VAV, PLCγ, SLP76 y la unidad subreguladora PI3K.

En pacientes con LES, respecto a controles sanos, se ha demostrado la interacción entre la proteína SYK con VAV y PLC, produciendo el aumento de las concentraciones de calcio intracelular y el aumento de las vías de señalización dependientes de calcio; otro cambio inducido por la señalización mediada por SYK es la polimerización de la actina 118,

  1. La IL-2 es un factor regulador muy importante en la respuesta del linfocito T; está involucrada en la modulación de la duración y la intensidad de la respuesta inmunitaria, también como factor de crecimiento para linfocitos T que se produce posterior a la estimulación del TCR.
  2. La IL-2 se ha caracterizado por ser un factor indispensable para la inducción de la tolerancia, generalmente a través de 2 mecanismos: activación de los mecanismos inducidos de muerte celular y por la inducción y mantenimiento de células T reguladoras.

Como elemento clave en la modulación entre la respuesta inmunitaria proliferativa y la inducción de la tolerancia, IL-2 debe ser estrechamente regulada en orden para mantener la homeostasis en la respuesta inmunitaria 119, La búsqueda de los mecanismos responsables en los cambios en la síntesis de IL-2 ha revelado una serie de alteraciones en el sitio de ocupación del factor de transcripción a nivel del promotor IL-2 de linfocitos T, obtenidas de pacientes con LES.

El sitio –180 ha demostrado ser especialmente importante en la desregulación de la transcripción de IL-2. Comprende un sitio de unión para CREB/CREM. Cuando CREB es fosforilado, actúa como un factor positivo que mejora la transcripción. Por otra parte, cuando CREM se activa, desplaza a pCREB y actúa como un represor transcripcional, evitando la unión de p300 y CBP.

Los cambios en los niveles de CREM están asociados con el complejo enzimático activar calcio/calmodulina dependiente de quinasa IV (CaMKIV). Los niveles de esta cinasa son más altos en células T derivadas de pacientes con LES 120,121, Linfocitos Th17, IL-7 y lupus eritematoso sistémico La activación crónica de la respuesta inflamatoria en pacientes con LES conlleva a la liberación de múltiples citocinas que van a contribuir activamente a la inflamación y el daño tisular.

Los diferentes subtipos de linfocitos T tienen la capacidad de secretar citocinas que ayudarán en la respuesta inflamatoria; de esta forma, los linfocitos Th1 son esenciales para controlar las infecciones por microorganismos intracelulares por medio de la secreción del IFN-γ, lo cual tiene la capacidad de activar macrófagos, mientras que los linfocitos Th2 producen IL-4, IL-5 e IL-13 que están involucradas en el control de parásitos y alérgenos por medio de la activación de eosinófilos.

Existe otro subtipo de linfocitos, conocidos como Th17, los cuales producen IL-17; esta interleucina tiene múltiples efectos inflamatorios, entre estos, inducir la secreción de otras citocinas, quimiocinas, de múltiples linajes celulares incluyendo células epiteliales y fibroblastos.

Promueve la proliferación, la maduración y el reclutamiento de neutrófilos a través de múltiples factores de crecimiento e IL-18, permite el reclutamiento de células inflamatorias, como macrófagos y otros linfocitos, así como la liberación de metaloproteinasas que causan destrucción del tejido conectivo 122,

En pacientes con LES se ha documentado un aumento de los conteos celulares de Th17, así como de las concentraciones plasmáticas de IL-17; sin embargo, no ha sido posible relacionar los niveles de IL-17 con el nivel de actividad lúpica, indicando que esta interleucina está constitutivamente y establemente producida en pacientes con LES independiente de la actividad de la enfermedad 123,

Aunque los pacientes con LES tienen un aumento de la producción de IL-17, el papel de esta citocina en la patogénesis del lupus no se encuentra bien estudiado. La IL-17 puede inducir la producción de múltiples mediadores inflamatorios de células inmunes y no inmunes que pueden participar en la activación de células inflamatorias y en daño tisular.

Conclusiones La activación del linfocito T es un proceso complejo con múltiples componentes que se relacionan entre sí; esta intricada maquinaria que inicia por el reconocimiento entre el TCR y un péptido montado sobre una molécula mayor de histocompatibilidad permite la activación de la familia de cinasas SRC, FYN y LCK, que fosforilan los residuos de tirosina de las secuencias ITAM presentes en las cadenas del CD3.

  1. Estos dominios fosforilados permiten la incorporación de ZAP-70, propagando de esta forma la señal a través de la fosforilación de la proteína de anclaje LAT que diversifica la señal reclutando nuevas cinasas.
  2. LAT propaga la señalización del TCR en 3 grandes vías importantes, la cascada MAP cinasa a través de GRB2 y GRAP, modificaciones en el citoesqueleto y liberación de calcio como segundo mediador por GADS.

Estas distintas vías terminarán en la activación de múltiples promotores que facilitarán la síntesis de citocinas que actuarán como efectores de la respuesta linfocitaria. La regulación de la activación del linfocito T es importante para finalizar la activación y evitar estados de anergia o autoinmunidad.

  1. Entre los componentes reguladores de la activación del linfocito T está el correceptor CTLA-4, la ubiquitinación y degradación de proteínas claves en la activación, el reclutamiento de SHIP1 por DOK1/2 y la activación de PTPN22.
  2. La alteración en mecanismos de activación y regulación puede conllevar a procesos de autoinmunidad como el LES, un desorden crónico con manifestaciones clínicas heterogéneas.

Se han descrito cambios clave, como alteraciones en la fosforilación o defectos en la expresión de las cadenas ζ del TCR, alteración en la expresión en los subtipos de linfocitos predominando los linfocitos Th17 con una elevación en IL-17 o cambios en proteínas claves para la transducción de la señal, como el cambio de las cadenas ζ del CD3 por Fc¿RIγ que generarán señales aberrantes en la activación linfocitaria.

Una vez conocido el mecanismo de activación normal del linfocito T, los mecanismos de señalización celular y la regulación de las vías de transmisión, podemos entender la patogenia de la enfermedad autoinmune y la heterogeneidad de las manifestaciones clínicas que la caracteriza. Adicionalmente, dicho conocimiento nos ha permitido hacer uso de elementos clave en señalización linfocitaria en búsqueda de herramientas diagnósticas con nuevos biomarcadores que permitan hacer un seguimiento de la enfermedad, su actividad y la investigación de nuevas dianas terapéuticas.

Selección de la información Para la realización de un artículo de revisión narrativo se realizó la búsqueda a través de la base de datos PubMed, usando los términos: ” T cell activation “, ” TCR signals “, ” Inmune cell signaling in lupus “, ” pathogenesis of systemic lupus “, ” Signal transduction TCR “, ” ITAM AND TCR “, ” T cell AND SYK “, ” ZAP-70 AND TCR “, ” TCR structure “, ” Regulation activation TCR “, ” TCR AND autoimmunity “, ” Lipid rafts AND T cell “.

Se seleccionaron artículos entre los años 1945 hasta 2017, artículos en inglés y español, y de tipo como review, clinical trial, research, editorials, opinion. Se seleccionaron aquellos artículos que explicaran la vía de señalización linfocitaria, así como aquellos estudios que estuvieran relacionados con alteraciones en la activación del linfocito T y la patogenia del LES.

De los artículos seleccionados, se identificaron las referencias de aquellos temas que se deseaban profundizar; posteriormente, se revisó el abstract y se determinaba si era pertinente o no para la revisión. También se seleccionaron artículos por medio de la opción de PubMed « similar article ».

Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Agradecimientos Agradecemos a Daniela Alejandra Gordillo por la realización de los gráficos y por su participación en la elaboración del manuscrito. Bibliografía J. Huang, C. Meyer, C. Zhu. T cell antigen recognition at the cell membrane.

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Curr Opin Rheumatol., 23 (2011), pp.444-448 J.C. Martín, D.L. Baeten, R. Josien. Emerging role of IL-17 and Th17 cells in systemic lupus erythematosus. Clin Immunol., 154 (2014), pp.1-12 Copyright © 2017. Asociación Colombiana de Reumatología

¿Qué hacen los linfocitos Th1?

EDITORIAL Los linfocitos Th1 no son exclusivos de la inmunidad celular Lymphocytes Th1 are not exclusive of cellular immunity Dr. Rolando Felipe Ochoa Azze* Departamento de Inmunología. Universidad Médica de La Habana. Ave.31 y 146, Playa, La Habana, Cuba.

  1. Email: [email protected] *Dr.
  2. En Medicina.
  3. Doctor en Ciencias Médicas.
  4. Profesor e Investigador Titular /Full Professor. MD, PhD.
  5. Los linfocitos T cooperadores CD4+ (Th de “helper”) se dividen en subpoblaciones, entre las que se destacan Th1 y Th2.
  6. A lo largo de mi vida profesional he observado que muchos investigadores asocian a la subpoblación Th1 exclusivamente con la inmunidad celular, incluso aquellos que trabajan en vacunología; criterio citado en presentaciones de eventos, artículos científicos, trabajos de diploma, tesis de especialidad o para grados científicos.

Al igual ocurre con diversos libros de texto. Pretendemos polemizar y mostrar que esta subpoblación no está limitada a esta vertiente de la inmunidad, y que es vital para la respuesta humoral. Ante todo destacar que la separación de la inmunidad en sus vertientes humoral y celular es puramente convencional.

Generalmente coexisten en un balance que se inclina de uno a otro lado según la característica del estímulo inmunogénico, y la necesidad subsiguiente de activar mecanismos capaces de contrarrestar la agresión biológica (1). Se pudiera ir más lejos, señalando a su vez que tampoco existe separación entre la inmunidad innata y la adquirida.

Recordemos tan solo los mecanismos efectores de la inmunidad humoral, en los que participan activamente las células fagocíticas y la lisis mediada por el complemento, entre otros. Se conoce que las células Th1 son necesarias para activar los macrófagos, de forma tal que sean capaces de fagocitar y destruir microorganismos.

  1. El Cellular and Molecular Immunology, de los autores Abul K Abbas, Andrew H Lichtman y ShivPillai, libro de consulta obligatoria para todo profesional dedicado a la inmunología, señala que esta es su principal función (2).
  2. Aseveración a mi juicio que debe matizarse, como más adelante se discutirá.
  3. Otros investigadores asocian solo el patrón de respuesta mediado por linfocitos Th2 con la inmunidad humoral propiamente dicha.

Estas células colaboran con las células B para la producción de anticuerpos de la clase IgG4 e IgE. Entonces, ¿cómo puede sostenerse que la mayor parte de las vacunas preventivas actualmente en el mercado estimulan la vertiente humoral del sistema inmune, si esta se asocia únicamente a las células Th2? Subpoblación que se activa ante helmintos y alérgenos.

  • Por supuesto que este enfoque no es correcto.
  • Las vacunas preventivas timodependientes de subunidades, ampliamente usadas en todos los esquemas de vacunación, inducen anticuerpos de la clase IgG; las proteicas o las de polisacárido conjugadas con proteínas portadoras, en cambio inducen anticuerpos de las subclases IgG1 e IgG3.

Características de la respuesta inducida por los linfocitos Th1, mediante mecanismos de cooperación celular. El cambio de isotipo ante el estímulo inmunogénico, natural o artificial, es regulado por las citocinas producidas por las células Th. Este varía según la subpoblación de linfocitos Th que se active, y que a su vez depende de la naturaleza del agente biológico y los mecanismos efectores necesarios para controlar la infección (3).

  • La afirmación de que las células Th1 son importantes en la inmunidad celular es cierta, pero a mi juicio incompleta.
  • No hay dudas de que para un adecuado funcionamiento de esta vertiente del sistema inmune se requiere de esta subpoblación, cuya célula efectora final es el macrófago activado, así como de la actividad de los linfocitos citotóxicos.

Sin embargo, la subpoblación Th1 juega un rol vital para la producción de anticuerpos dirigidos contra el agente infectante o sus productos tóxicos (4). Dentro de los anticuerpos protectores se incluyen los que inactivan los productos tóxicos solubles, facilitan la fagocitosis y la digestión intracelular de los microorganismos, fijan el complemento sérico para dañar cápsulas y membranas y neutralizan la proliferación de los gérmenes infectantes (1, 5).

  • Los anticuerpos son eficaces no solo contra bacterias extracelulares, sino contra muchas enfermedades virales, evitando la penetración celular y previniendo que se alcance el órgano blanco, como sucede en el caso del poliovirus o el virus de la hepatitis B.
  • La función efectora de los linfocitos Th1 está mediada por citocinas, que estimulan no sólo la secreción y el cambio de clase de anticuerpos, también inducen inflamación local e incrementan la actividad fagocítica y microbicida de los macrófagos.

De esta forma se integran ambas vertientes del sistema inmune. Se conoce que la defensa contra agentes biológicos en el espacio extracelular es mucho más compleja, y requiere del concurso de diversas células del sistema inmune: los linfocitos Th1 y Th2 ya descritos, los linfocitos Th foliculares y los Th17.

  • Además de las células B activadas y las subsecuentes células plasmáticas, sin olvidar las imprescindibles células presentadoras de antígenos, fagocitos mononucleares, neutrófilos, mastocitos, basófilos y eosinófilos. El Dr.
  • Andrew H Lichtman, coautor del libro que se citó en varias oportunidades, participó como profesor en el AdvancedImmunologyCourse que se realizó en La Habana en el mes de mayo del año 2011.

En su conferencia, titulada “CellMediatedImmunity: Helper T Cells” se refirió a errores conceptuales comunes acerca de las subpoblaciones Th1 y Th2, dados por restringir la inmunidad humoral a esta última y limitar la primera subpoblación a la inmunidad celular.

Sin embargo, es lamentable que estos criterios no queden claramente definidos y sin ambages en el libro que nos ocupa. La inmunidad a mi juicio es una sola, las subpoblaciones linfocitarias, mejor definidas en modelos murinos que en humanos, se encuentran en un equilibrio dinámico. Su expansión, diferenciación o restricción, dependerá de la naturaleza del agente biológico.

Por otra parte, la respuesta innata se encuentra en la génesis de la adquirida, participa en la fase de reconocimiento y activación de la misma, así como en sus mecanismos efectores. ¿Cuál es la importancia práctica de estos conceptos para la vacunología? Puede resumirse señalando que el desarrollo de vacunas debe tener en cuenta la estimulación preferencial de la vertiente del sistema inmune que sea más idónea para prevenir, controlar o eliminar la enfermedad.

  1. REFERENCIAS 1.
  2. Ochoa R, Sierra G, Martínez I, Cuevas I.
  3. Mecanismos de defensa frente a las infecciones (II).
  4. Fase efectora de la respuesta inmune.
  5. Capítulo 3.
  6. En: Prevención de la enfermedad meningocócica.
  7. La Habana: Finlay Ediciones; 2010.p.43-57.2.
  8. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai SH, editors: Effector Mechanisms of Cell-Mediated Immunity.

Chapter 10. In: Cellular and Molecular Immunology.7th ed., Philadelphia: Saunders; 2011.p.225-42.3. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai SH, editors: B Cell Activation and Antibody Production. Chapter 11. In: Cellular and Molecular Immunology.7th ed., Philadelphia: Saunders; 2011.p.243-68.4.

¿Qué hacen los linfocitos Th2?

Estudio del patrón de citocinas (Th1/Th2) producido por linfocitos T periféricos y del existente en tejido tumoral de pacientes con melanoma en diferentes estadios* | Actas Dermo-Sifiliográficas INTRODUCCIÓN Las respuestas inmunes pueden agruparse en dos grandes categorías: respuesta inmune innata y respuesta inmune adaptativa.

La respuesta indeltamune innata es inespecífica, constituye la primera barrera de defensa frente a las infecciones, y la llevan a cabo los granulocitos y los macrófagos que reconocen ciertas moléculas que se encuentran en la superficie de muchas bacterias, y a partir de ahí proceden a fagocitarlas, a la vez que inducen la secreción de citocinas 1-3,

La respuesta inmune adaptativa es aquella generada por los linfocitos T y B, que tras el encuentro con el antígeno para el que están específicamente predeterminados se multiplican y producen citocinas e inmunoglobulinas. Las citocinas son proteínas solubles de bajo peso molecular liberadas por las células que afectan la función o propiedades de otras células.

Las citocinas son producidas por otras muchas células, además de las del sistema inmune, pero es en estas últimas en donde desempeñan un papel más relevante, especialmente entre los linfocitos T, que dependen de ellas para llevar a cabo sus efectos, actuando sobre una amplia gama celular: células B, células T, macrófagos, células tisulares y células hematopoyéticas.

Para ejercer su función las citocinas se unen a receptores específicos presentes en las células sobre las que actúan. A finales de la década de los ochenta se describieron tanto en ratones como en seres humanos dos subgrupos de linfocitos T helper (colaboradores) atendiendo al patrón de citocinas que producían, y se les denominó T helper 1 (Th1) y T helper 2(Th2) 4,5,

En respuesta a la estimulación antigénica, los linfocitos Th1 producen interleucina (IL)2 e interferón γ (IFN-γ) y estimulan la inmunidad mediada por las células. Los linfocitos Th2 segregan IL-4, IL-5 e IL-10, favorecen la inmunidad humoral, e inducen la producción de anticuerpos. Las respuestas extremas de este espectro son capaces de inhibir el desarrollo de la contraria, y así el IFN- producido por las células Th1 puede inhibir la proliferación de las células Th2.

Contrariamente, la IL-4 y la IL-10 producidas por las células Th2 pueden inhibir la proliferación de las células Th1 6-8, ¿Qué es lo que determina que la respuesta inmune se decante hacia la producción de linfocitos T con fenotipo Th1 o Th2? Aunque actualmente no existe una respuesta clara a esta pregunta, la teoría más aceptada implica a ciertas citocinas.

La IL-12 y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) producido por los macrófagos presentadores de antígenos son fuertes promotores de las respuestas Th1 9,108,10, Actualmente sabemos que varias enfermedades cutáneas están caracterizadas por una respuesta Th2: el síndrome hipereosinofílico idiopático 11, el penfigoide ampolloso 12, la dermatitis atópica 13,14, la lepra lepromatosa multibacilar 15,16, e incluso una enfermedad neoplásica como el síndrome de Sézary 17-20,

A diferencia de esto, en la lepra tuberculoide 15,16, en la psoriasis 21 y en el herpes gestationis 22 existe un predominio de la respuesta Th1. Centrándonos en las neoplasias cutáneas, los estudios realizados en los linfomas cutáneos de células T (micosis fungoide y enfermedad de Sézary) han llevado a generar una atractiva hipótesis sobre el papel de la respuesta Th1/Th2 en su etiopatogenia.

  1. En un interesante trabajo, Saed et al estudiaron el perfil de las citocinas de los linfocitos T en la epidermis, dermis y sangre periférica de pacientes con linfomas cutáneos de células T 17,
  2. Previamente, Vowels et al habían demostrado la existencia de un patrón de producción de citocinas Th2 en las células neoplásicas procedentes de sangre periférica de pacientes con síndrome de Sézary 18,19,

El propósito del trabajo de Saed et al era determinar si existía una diferencia en el patrón de citocinas y por tanto el tipo de linfocitos T asociados con la MF con respecto al del síndrome de Sézary. Después de extraer el ARN total por separado de la epidermis, dermis y leucocitos de sangre periférica, sintetizaron un ADN complementario y realizaron una amplificación con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores para las citocinas asociadas con un patrón Th1 (IL-2, IFN-γ) y para las asociadas con un patrón Th2 (IL-4, IL-5 IL-10).

  1. Sus resultados mostraron que todas las muestras de MF contenían ARN mensajero de IL-2 e IFN-γ sólo en la epidermis, mientras que en la variante leucémica, el síndrome de Sézary, se encontró un patrón dominado por la IL-4, IL-5 e IL-10 tanto en la epidermis como en sangre periférica.
  2. Los pacientes con MF mostraban en sangre periférica un patrón superponible al encontrado en sangre periférica de sujetos normales, con una mezcla de citocinas de los dos patrones.

Una hipótesis interesante para explicar este cambio en el patrón de citocinas hallado en la MF (Th1) con respecto al síndrome de Sézary (Th2) sería que todas las células neoplásicas son del tipo Th2, de tal forma que inicialmente el infiltrado inflamatorio reactivo (Th1) que intenta controlar a las células malignas es masivo, y así sucede que la MF puede permanecer indolente durante un largo período de tiempo hasta que finalmente esta respuesta de control de los Th1 es superada por el mayoritario fenotipo Th2 del clon maligno existente en sangre periférica y en la piel del síndrome de Sézary 20,

  • En el presente estudio hemos trasladado nuestro interés a la respuesta inmune existente en el melanoma, comparando pacientes que se encontraban en diferentes estadios evolutivos.
  • Esto nos pareció importante, en primer lugar por la relevancia conocida que la respuesta inmunológica tiene frente a este tumor, y en segundo porque puede aportar claves para abordar la terapia de estos pacientes.

Nuestro propósito era averiguar si existía un patrón predominante Th1 o Th2 en los pacientes con melanoma en diferentes estadios y compararlos con sujetos controles sanos. A priori, una respuesta Th1, en donde se favorezca la inmunidad celular (linfocitos T), sería la más adecuada para la lucha antitumoral, mientras que la respuesta Th2 sería menos efectiva en pacientes con tumores diseminados.

Con esta premisa nos planteamos las siguientes hipótesis: a) en los controles existiría un predominio de la respuesta Th1 frente a los pacientes con melanoma, considerados como un grupo; b) en los pacientes con melanoma localizado existiría una respuesta Th1, mientras que en los melanomas metastásicos existiría una respuesta Th2, y c) por último, nos planteamos una comparación en el patrón de citocinas de los pacientes con melanoma localizado y con más de 2 años de evolución, esto es, aquellos en los que la enfermedad parece estar más controlada, con el de pacientes con melanoma metastásico.

Para verificar o rechazar estas hipótesis estudiamos mediante citometría de flujo el patrón de citocinas producido por los linfocitos T circulantes en pacientes con melanoma en diferentes estadios. En una segunda parte del trabajo nos propusimos estudiar esas diferencias en el patrón Th1/Th2 entre la piel sana de un sujeto control y las lesiones de melanoma tanto localizado como metastásico.

Para ello utilizamos una técnica de transcriptasa inversa seguida de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) cuantitativa. MATERIAL Y MÉTODOS Pacientes Hemos incluido en la primera parte de este trabajo a 19 pacientes y 6 controles. Los 19 pacientes tenían melanomas invasivos. De los 6 controles, 5 eran personal sanitario de nuestro hospital que acudieron a realizarse controles hematológicos como parte de un examen de salud rutinario, y en los que se obtuvo consentimiento antes de incluirlos en el presente estudio, y 1 era un paciente que acudió a revisión 2 años después de que se le hubiese extirpado un carcinoma basocelular y sin que hubiese presentado ninguna recidiva.

En todos ellos se realizó una única determinación. En la tabla 1 están recogidas las principales características clínicas e histológicas de los melanomas incluidos en la primera parte del estudio. La clasificación utilizada es la de la American Joint Commitee on Cancer (AJCC) de 1992.

De forma resumida, de los 19 pacientes que componían el grupo de estudio, 6 pertenecían al estadio I de la AJCC (melanoma localizado con un Breslow inferior a 1,5 mm), 5 al estadio II (melanoma localizado con un Breslow superior o igual a 1,5 mm) y 8 tenían un melanoma metastásico diseminado (estadio IV).

Para la segunda parte del trabajo se obtuvieron biopsias de 3 milímetros de diámetro mediante un punch de una zona de piel sana de un sujeto control, de un nevus melanocítico intradérmico de larga evolución, de tres melanomas localizados y de tres pacientes con melanomas con metástasis cutáneas.

  • Métodos
  • Citometría de flujo
  • La sangre de controles y pacientes fue recogida en tubos que utilizaban como anticoagulante la heparina y procesada antes de 4 horas tras la extracción.

Para inducir la síntesis de citocinas se diluyó la sangre entera en medio RPMI 1640 (1:1 v/v) y se añadió un bloqueador del transporte de proteínas a la membrana (GolgiStop). Las células se estimularon con 25 ng/ml de forbol miristato acetato (PMA) y 1 µg/ml de ionomicina, codiciones experimentales que conducen a la activación de las células.

  1. En el estudio se utilizaron tres controles de la activación celular:
  2. 1) El control de la activación basal se realizó diluyendo la sangre entera con RPMI-1640 sin añadir GolgiStop ni estímulo con PMA ni ionomicina.
  3. 2) El control de la expresión de marcadores de activación celular en la membrana plasmática se obtuvo diluyendo la sangre entera en RPMI sin GolgiStop y estimulando con PMA e ionomicina a las concentraciones antes mencionadas.
  4. 3) El control de la expresión intracelular de marcadores de activación se preparó de la misma manera que el estudio de producción de citocinas, es decir, diluyendo la sangre entera con RPMI y GolgiStop y estimulando las células con PMA e ionomicina.

Para la determinación de la síntesis de citocinas en tubos de 12 x 75 mm se alicuotaron 100 µl de muestra de sangre entera activada. Las células se marcaron en superficie con 20 µl de anticuerpo CD8-FITC y 20 µl de CD3-Cy5. Mediante el kit CytoFix-CytoPerm se fijaron y se permeabilizaron las células.

  1. En estas condiciones se realizó el marcaje intracelular con 15 µl del anticuerpo monoclonal específico para cada una de las siguientes citocinas: IL-2, IL-4, IL-10, TNF-alfa e IFN-gamma, así como el control de marcaje inespecífico, IgG1 o IgG2.
  2. Todos estos anticuerpos monoclonales para el marcaje intracelular estaban conjugados con ficoeritrina (PE).

Los tubos de control de la activación basal y de superficie se prepararon con 100 µl de la dilución de sangre entera correspondiente y 10 µl de anticuerpo CD69-Cy5, que detecta la expresión en superficie de un marcador de activación celular. Las muestras se lisaron y fijaron mediante el sistema TQ-Prep.

  • El control de la expresión intracelular de marcadores de activación se realizó con una alícuota de 100 µl de la muestra de sangre correspondiente y 10 µl de CD69-Cy5.
  • La permeabilización y fijación de las células se realizó con el kit CytoFix-CytoPerm.
  • Todas las muestras fueron analizadas inmediatamente con un citómetro de flujo EPICS XL-MCL.

Los resultados fueron cuantificados con el programa de análisis SYSTEM II instalado en el ordenador del citómetro. RT-PCR cuantitativa a tiempo real Para cuantificar los transcritos (mARN) de las diferentes citocinas se utilizó la técnica de la RT-PCR cuantitativa a tiempo real.

El método empleado para la obtención de los datos cuantitativos de la expresión génica relativa es el método de comparación de las Ct (método ΔΔCt) tal y como se describe en el boletín del usuario n.º 2 de la empresa Applied Biosystems, La fórmula utilizada para el cálculo de la expresión génica relativa es: nivel de inducción = 2 ­(ΔΔCt), donde ΔΔCt = (CtGI ­ Ct rRNA 18S ) ­ (CtGI ­ Ct rARN 18S ), Ct es el ciclo umbral, a partir del cual se observa un aumento de fluorescencia con respecto a la fluorescencia basal del sistema (los valores de Ct son inversamente proporcionales a los niveles de mARN diana presentes en la muestra a estudiar), GI es el gen de interés (cada uno de los genes de las citocinas en este trabajo), rARN 18S es el ARN de la subunidad 18 S ribosomal que se utiliza como control endógeno, el calibrador es una muestra de piel sana, y las muestras cuya expresión queremos determinar corresponden a un nevus, tres melanomas localizados y tres melanomas metastásicos.

En estos experimentos, el ARN total se extrajo de cada una de las muestras con el reactivo TRIzol (GIBCO- Life Technologies ) siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante. La transcripción inversa para generar el cADN se realizó por el sistema TaqMan Reverse Transcription Reagents ( Applied Biosystems, P/N N808-0234) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

  • La reacción de RT contenía, en un volu-men final de 100 µl, 1X tampón RT, 5,5 mm MgCl 2, 500 µm de cada desoxinucleótido trifosfato, 2,5 µm de random hexamers, 0,4 U/µl de inhibidor de RNasas, 1,25 U/µl de transcriptasa inversa MultiScribe y 2 µg de ARN total.
  • Las muestras se incubaron a 95° C durante 10 minutos y 48° C durante 30 minutos, seguido de 95° C durante 5 minutos para inactivar la transcriptasa.

Las reacciones de PCR se analizaron con la TaqMan Cytokine Gene Expresion Plate I ( Applied Biosystems P/N 4304671). La placa tiene 96 pocillos ordenados en 12 columnas, una para cada citocina. En los pocillos de cada columna se encuentran los primers y la sonda TaqMan para cada una de las citocinas y el rARN 18S utilizado como control endógeno.

  • La amplificación simultánea de un control endógeno con el gen diana se utiliza para normalizar la cantidad de ARN añadido a cada reacción.
  • Cada PCR se realizó en un volumen de 50 µl conteniendo 5 µl de la reacción de transcripció n inversa y 1X TaqMan Universal PCR Master Mix ( Applied Biosystems P/N 4304437).

Las condiciones de PCR comprendían un paso inicial de 95° C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos a 95° C durante 15 segundos y 60° C 1 minuto. La cuantificación se realizó con el ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems).

  • Metodología estadística
  • Los datos experimentales de la primera parte del estudio se procesaron con los programas estadísticos GW-BASIC y SPSS-PC de acuerdo a:
  • 1) Metodología estadística descriptiva: estadísticas básicas, reduciendo los datos a sus parámetros de centraje, dispersión y tamaño (x = media aritmética, s = desviación típica; n = número de casos) para todos los datos cuantitativos.
  • 2) Metodología estadística analítica: cruce de variables cuantitativas utilizando las siguientes pruebas para el análisis de la varianza; F de Fisher y «t» de Student para diferencias de medias.
  • RESULTADOS
  • Analizaremos los resultados del estudio de cito-metría de flujo en sangre periférica, atendiendo en primer lugar al porcentaje de células productoras de cada citocina. Desglosaremos los datos, analizando cada citocina y para cada una de ellas comentaremos los resultados obtenidos al comparar:
  • 1) Grupo de estudio y grupo control (tabla 2).
  • 2) Los tres subgrupos de estudio (estadio I, II y IV de melanoma) y grupo control (tabla 3).
  • 3) Melanoma localizado (estadios I y II) frente a melanoma mestastásico (tabla 3).
  • 4) Pacientes a los que se les había extirpado un melanoma cutáneo y se encontraban libres de enfermedad durante un período de más de 2 años, con pacientes con melanoma metastásico.
See also:  De Que Color Se TiEn Los Linfocitos?

En segundo lugar hemos analizado la intensidad de expresión de cada citocina por parte de aquellos linfocitos que las producen (unidades arbitrarias de fluorescencia). Para ello hemos cuantificado la intesidad de fluorescencia de los anticuerpos unidos específicamente a las células productoras de citocinas (tabla 4).

En la figura 1 puede observarse un ejemplo de la estrategia citométrica seguida para determinar la producción de citocinas por los linfocitos T. Se muestran los histogramas utilizados para seleccionar la población de linfocitos, por sus características morfológicas, y las subpoblaciones de linfocitos CD4 y CD8, por marcaje con anticuerpos CD3 y CD8.

Por último se muestran los histogramas utilizados para la cuantificación de niveles intracelulares de citocinas. La figura 2 recoge los porcentajes de expresión de citocinas agrupando a los pacientes según su estadio clínico. Fig.1.- Ejemplos ilustrativos de la estrategia citométrica seguida para la determinación de citocinas intracelulares en linfocitos sangre entera.

  • A: histograma biparamétrico de tamaño (FS) frente a complejidad (SS) donde se acota la población de linfocitos.
  • B: control de activación celular; superposición de histogramas de distribución en linfocitos de la expresión del marcador de activación CD69, mostrando la expresión positiva (trazo rojo) de las células activadas con PMA + ionomicina en las mismas condiciones experimentales de inducción de síntesis de citocinas frente a una población control, no estimulada (trazo verde).

C: histograma de complejidad (SS) frente a la fluorescencia roja del anticuerpo CD3-Cy5, identificando la población de linfocitos T (CD3+) seleccionada para el análisis citométrico. D: histograma biparamétrico de fluorescencia roja de CD3-Cy5 frente a fluorescencia verde de CD8-FITC que identifica las subpoblaciones CD4 y CD8 de los linfocitos T, acotados como en la gráfica C, los linfocitos CD4 corresponden a la población CD3+CD8­ (cuadrante superior izquierdo).

E: histograma biparamétrico de fluorescencia verde del anticuerpo CD8-FITC frente a la fluorescencia naranja del anticuerpo irrelevante IgG2b, mostrando el ajuste de los cursores para determinar la población negativa (cuadrantes izquierdos) en el análisis de la síntesis de citocinas en linfocitos T, acotados como se muestra en la gráfica C.

F y G: histogramas biparamétricos de fluorescencia verde de CD8-FITC frente a la fluorescencia naranja del anticuerpo, marcado con PE, específico frente a interferón gamma (IFNγ-PE), mostrando simultáneamente la expresión de dicha citocina en linfocitos T CD4+ y CD8+.

  1. Este tipo de histograma se utiliza para cuantificar, a partir de los cuadrantes derechos, el porcentaje de células que sintetizan cada una de las citocinas estudiadas y la intensidad relativa de expresión de las mismas.
  2. F: muestra un ejemplo de un paciente en estadio I.
  3. G: muestra un ejemplo de un paciente en estadio IV.

Fig.2.- Expresión de citocinas intracelulares en linfocitos T CD4+ y CD8+ de sangre entera de controles sanos y pacientes con melanoma, en función del estadio clínico de la enfermedad. Los gráficos muestran el porcentaje de células positivas para cada una de las citocinas en cada sujeto analizado (eje de ordenadas) dependiendo del estadio clínico de la enfermedad (control, estadios I, II y IV, eje de abscisas).

Cada punto representa un sujeto de estudio. La barra horizontal indica la media de los valores obtenidos. Detallaremos los resultados obtenidos para cada citocina: Respecto al IFN- γ existe una diferencia estadísticamente sigificativa entre el porcentaje de células, tanto CD4 como CD8, que producen IFN-γ entre los controles y los pacientes con melanoma, siendo siempre mayor el número de células productoras de esta citocina en los primeros.

Cuando desglosamos el grupo de estudio en tres subgrupos, según la clasificación de la AJCC y realizamos un análisis de la varianza con la prueba de Fisher considerando estos tres grupos y el grupo control, observamos que existen diferencias estadísticamente significativas entre todos ellos.

  1. Sin embargo, no existen diferencias entre el porcentaje de células productoras de IFN-γ al comparar pacientes con melanoma localizado (estadio I + estadio II) con pacientes con melanoma metastásico (estadio IV).
  2. Tampoco hallamos ninguna diferencia cuando comparamos los pacientes con melanoma localizado de más de 2 años de evolución con los pacientes con melanoma metastásico.

Al considerar la intesidad de expresión del IFN-γ por los linfocitos CD4 y CD8 observamos que existen diferencias estadísticamente significativas en el análisis de la variaza con la F de Fisher entre los tres grupos de estudio (estadio I, II y IV) en lo referente a los linfocitos CD4, mientras que en los linfocitos CD8 las diferencias se encuentran muy cerca de la significación.

No existe, sin embargo, ninguna diferencia al considerar a los estadios localizados del melanoma (I + II) y al metastásico diseminado, y tampoco los localizados con un intervalo de superviviencia superior a los 2 años frente a los metastásicos. Respecto a la IL-10 existe una diferencia estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD4 que producen IL-10 al comparar los controles con los pacientes con melanoma, de forma que en los pacientes con melanoma es mayor el número de lifocitos que producen esta citocina.

Sin embargo, ocurre lo contrario cuando consideramos el número de células CD8 productoras de IL-10, ya que aquí también existe una diferencia con significación estadística, pero los valores mayores los encontramos en los controles. Al igual que mencionamos para el IFN-γ, existe una diferencia significativa al comparar tanto el porcentaje de células CD4 como el de CD8 que producen IL-10 en los estadios I, II, IV y en el grupo control.

Sin embargo, cuando comparamos los pacientes con melanoma localizado (estadios I y II) con los pacientes con melanoma metastásico, las diferencias no alcanzan significación estadística. Sin embargo, es interesante observar que parece existir un espectro en el porcentaje de células CD4 que producen IL-10, en el que los controles son los que tienen menos células productoras de IL-10, los pacientes con melanoma metastásico tienen el porcentaje mayor, y los pacientes con melanoma localizado se encuentran en un punto intermedio.

Respecto al número de linfocitos CD8 productores de IL-10, se observan resultados discordantes, ya que el mayor número de células productoras se encuentra en los controles y el menor en los localizados. No hemos encontrado diferencias al comparar los pacientes con melanoma localizado de más de 2 años de evolución con los pacientes con melanoma metastásico.

  • Cuando consideramos la intesidad de expresión de esta citocina por parte de las células CD4 y CD8, no existen diferencias significativas entre los tres grupos de estudio.
  • Tampoco hay diferencias al agrupar los estadios I y II y compararlos con el grupo metastásico, ni entre los localizados que llevan más años libres de enfermedad y los metastásicos.

Respecto a la IL-2 como se aprecia en la tabla 2, no existe una diferencia significativa al comparar el grupo control con el grupo de los melanomas. Sin embargo, al desglosar el grupo de estudio y agrupar a los pacientes según los diferentes estadios de la AJCC, nos encontramos que al realizar un análisis de la varianza con la F de Fisher, las diferencias son significativas.

  1. Observamos en la tabla 3 un aumento progresivo en la proporción de células CD4 productoras de IL-2 al comparar al grupo control con el estadio I y al estadio I con el estadio II.
  2. Sin embargo, en los pacientes con metástasis el porcentaje desciende y se sitúa entre el estadio I y II.
  3. No existe significación estadística cuando restringimos la comparación a los pacientes con melanoma localizado (estadio I + estadio II) y los que tienen melanoma mestastásico.

Tampoco encontramos diferencias a considerar al introducir el factor tiempo, es decir, comparando a los pacientes con melanoma localizado con un período libre de enfermedad superior a 2 años con los pacientes con metástasis de melanoma. Al valorar la intesidad de expresión de la IL-2 no existen diferencias significativas en lo referente a los linfocitos CD4.

Sin embargo, la intensidad de expresión por parte de los linfocitos CD8 está en los límites de la significación (p = 0,054). No existes melanomas localizados con el período libre de enfermedad mayor de 2 años con los metastásicos. Respecto a la IL-4, no hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas, ni siquiera una tendencia reseñable, al analizar los resultados obtenidos para esta citocina y realizar las comparaciones entre los grupos establecidos.

En cuanto a la intensidad de expresión de la IL-4, no existen diferencias en ninguna de las comparaciones realizadas. Respecto al TNF-α tampoco se observan diferencias entre los grupos estudiados. En lo referente a la intensidad de expresión del TNF-alfa, no existen diferencias en ninguna de las comparaciones establecidas.

Respecto a los linfocitos CD8, no existen diferencias significativas entre el grupo control y el grupo de los melanomas considerados en conjunto. No existe una significación estadística al realizar un análisis de la varianza y comparar a los tres grupos de estudio y el grupo control. Sin embargo, sí existe un número mayor de células CD8 en los pacientes de melanoma metastásico en relación con los melanomas localizados, es decir, cuando se agrupan los estadios I y II, y esta diferencia es estadísticamente significativa.

No observamos diferencias entre los melanomas localizados con período libre de enfermedad superior a 2 años y los metastásicos. Expresión de citocinas en el tumor Respecto a la segunda parte de nuestro trabajo hemos estudiado en la propia lesión de melanoma la presencia de ARN mensajero de distintas citocinas y la hemos cuantificado frente a un control de piel normal.

  1. Los resultados se resumen en la tabla 5.
  2. Podemos observar que el nevus expresa niveles similares a los de la piel normal de IFN-γ y TNF-α, y el resto de transcritos se encuentran en niveles indetectables.
  3. Los pacientes SA y CR muestran un patrón Th2, mientras que ALH y AC muestran un patrón Th0.
  4. No se observa ninguna correlación entre el patrón Th2 o Th0 y el hecho de que el melanoma sea primario o metastásico.

El paciente PT presenta una discreta elevación de la IL-10 (1,35) y el paciente BA presenta un aumento en el TNF-α (3,53) y en la IL-5 (1,93), por lo que es difícil adscribirlo a ningún patrón específico. DI SCUSIÓN Desde la descripción en 1986 por Mosmann et al de la existencia en ratones de dos subgrupos de linfocitos T helper, Th1 y Th2, según su patrón de producción de citocinas, se han producido multitud de avances en este tema, muchos de los cuales han servido no sólo para explicarnos mejor la patogenia de diversas enfermedades, sino para abrir camino a nuevos tratamientos.

  1. Como ya hemos mencionado, los linfocitos Th1 producen IL-2 e interferón-gamma IFN-γ, mientras que los linfocitos Th2 producen IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13.
  2. En seres humanos se ha comprobado que existen unos patrones Th1 y Th2 similares, aunque la producción de IL-2, IL-6, IL-10 e IL-13 no está completamente restringida a un solo subgrupo de células T como ocurre en los ratones 8,

Los linfocitos T CD8 también producen citocinas, y aunque se caracterizan por la expresión de un patrón de tipo Th1 8, existen evidencias claras de la existencia de células T CD8+ con un patrón de tipo Th2, tanto en ratones como en humanos 23,24, En la actualidad conocemos que existe una mayor complejidad entre estos patrones extremos que se identificaron inicialmente.

  1. Se han identificado células T que producen las citocinas correspondientes a ambos patrones (Th0) y a las que se considera precursoras indiferenciadas de las Th1 o Th2 25,
  2. Un ejemplo del patrón Th0 se ha encontrado en los pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), en los que se ha detectado la expresión de grandes cantidades tanto de IFN-γ como de IL-10, sin que estos niveles se vean alterados en el curso de la infección.

Además, las células que expresan estas citocinas son mayoritariamente CD8+ 26, La expresión de IL-2 e IL-4 era prácticamente indetectable independientemente del estado de la infección por el VIH. Por otra parte, existen células T helper con propiedades reguladoras (Th3) que producen cantidades elevadas del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) e IL-10 y pueden suprimir las respuestas antígeno-específicas in vivo e in vitro 27,28,

  1. Además se han observado grandes diferencias cuantitativas en la producción de citocinas entre distintos clones pertenecientes al patrón Th1 y entre los pertenecientes al Th2 8,
  2. Las interpretaciones de esta complejidad oscilan entre aquellas que consideran que existe un modelo con dos (Th1/Th2) o más (Th0/Th3) fenotipos, con diferencias cuantitativas según el momento de desarrollo de los linfocitos, hasta aquellas que proponen un modelo sin subgrupos definidos, en el que existiría un continuo con diferentes combinaciones en la secreción de citocinas 29,

La explicación de los resultados del presente trabajo es compleja y puede estar sujeta a distintas interpretaciones. La más sencilla de ellas nos llevaría a considerar que en los sujetos controles existe un predominio de la respuesta Th1, caracterizada aquí por un porcentaje elevado de linfocitos T que producen IFN-γ y una menor abundancia de los linfocitos CD4 que producen IL-10, en contraposición a lo que ocurre en los pacientes con melanoma, que presentan un número inferior de linfocitos T productores de IFN-γ y un porcentaje mayor de células CD4 productoras de IL-10.

Los porcentajes de lifocitos productores de IFN-γ son similares en los pacientes con melanoma en diferentes estadios. Sin embargo, aunque no existen diferencias estadísticamente significativas, se observa un gradiente de células CD4 productoras de IL-10 en la sangre de los pacientes con melanoma con arreglo al estadio en que se encuentran, de manera que los pacientes con un melanoma más avanzado tienen un mayor número de células que producen esta citocina.

La IL-10 está implicada en diferentes procesos del sistema inmunitario para conseguir un efecto antiinflamatorio e inmunosupresor 30, La IL-10 posee una acción inhibidora sobre las células presentadoras de antígenos y sobre la respuesta inmune mediada por células T.

  1. En modelos murinos se ha demostrado que la IL-10 inhibe la presentación de los antígenos tumorales por las células presentadoras de antígenos de la epidermis 31,
  2. Se ha demostrado, incluso, que cuando se tratan las células de Langerhans con IL-10 se induce un estado de tolerancia antigénica específica en los linfocitos TH1, mientras que esto no ocurre con los clones de linfocitos TH2 32,

Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en los modelos murinos en los que la IL-10 es producida sólo por los linfocitos TH2 y suprime la respuesta TH1, en los s eres humanos la IL-10 es producida por las células TH1 y TH2 y suprime la función de ambos tipos celulares 33,

  • Este efecto parece estar mediado, como acabamos de mencionar, a través de la inhibición de las células presentadoras de antígenos 33,34,
  • Se ha demostrado que la IL-10 inhibe la producción de múltiples citocinas, entre las que se encuentran la IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa y la propia IL-10 35-37,
  • En contraste, la IL-10 posee propiedades estimuladoras sobre las células CD8 y actúa atrayéndolas, activándolas y favoreciendo su proliferación 38-41,

Lo que resulta muy interesante es que la activación de las células T en presencia de IL-10 puede inducir un estado de no respuesta o anergia que no puede ser revertido en presencia de IL-2 o estimulación con anti-CD3 o anti-CD28 42, El papel de la IL-10 en la inducción y mantenimiento de la anergia vino sugerido por estudios en diferentes campos, entre ellos la respuesta inmune antitumoral 43,

La anergia mediada por la IL-10 puede estar asociada con la inducción de una población de células T reguladoras que producen niveles elevados de IL-10 y pueden suprimir las respuestas antígeno-específicas in vivo e in vitro 27,28,44,45, Refiriéndonos en concreto a la asociación entre la IL-10 y el cáncer, varios trabajos han apuntado la relación existente entre niveles elevados de expresión de IL-10 con varios tumores, entre ellos el melanoma 46-49,

Los mecanismos por los que esto puede ocurrir son básicamente dos, bien porque la IL-10 actúe como un factor de crecimiento para las células tumorales 50 o porque la IL-10 producida por, o en la vecindad del tumor, puede dificultar la inducción o la función efectora de la respuesta inmune antitumoral 51,52,

  1. Todo lo expuesto hasta aquí explicaría gran parte de nuestros resultados, ya que hemos encontrado que existe una diferencia estadísticamente significativa en la población de células CD4 productoras de IL-10 al comparar a los pacientes con melanoma (en los que es mayor) con el grupo control.
  2. Esto explicaría la disminución existente no sólo en el porcentaje de linfocitos CD4 y CD8 productores de IFN-γ, sino también el menor número de linfocitos CD8 productores de IL-10, ya que como hemos mencionado la IL-10 es capaz en los seres humanos de inhibir tanto las respuestas Th1 como las respuestas Th2 33,

Centrándonos en el análisis del grupo de estudio, observamos que los pacientes con melanoma metastásico poseen una población de células CD4 productoras de IL-10 sustancialmente más elevada (aunque no se alcancen diferencias con significación estadística) que los pacientes con melanoma localizado.

De esta forma existe un gradiente en el porcentaje de células CD4+ productoras de IL-10, con niveles menores en los sujetos controles, intermedios en los pacientes con melanoma localizado y los mayores en los pacientes con metástasis. Esto explicaría el único dato estadísticamente significativo que hemos obtenido al comparar el grupo de pacientes con melanoma localizado y los metastásicos, que es el aumento en el número de linfocitos CD8 en estos últimos, y a la vez ayudaría a comprender este dato que, en principio, puede parecer contradictorio, esto es, que aumenten los linfocitos CD8 y, sin embargo, los pacientes evolucionen hacia un estado de peor respuesta frente a su tumor.

Como hemos comentado, la activación y proliferación de los linfocitos T en presencia de IL-10 puede conducir a un estado de anergia frente al tumor. La mayor población de células CD4 productoras de IL-10 en los pacientes con melanoma metastásico respecto al estadio II también ayuda a entender la menor cantidad de linfocitos CD4 y CD8 productores de IL-2 en el melanoma metastásico, indicando que se produce una inhibición en la producción de IL-2.

  • A la luz de los resultados encontrados nos parece importante señalar una serie de vías para proseguir estas investigaciones.
  • En primer lugar, es evidente que existen importantes diferencias personales en la respuesta inmune que complican especialmente la interpretación de los datos, y estas diferencias pueden apreciarse observando la producción de citocinas en los controles.

Esto hay que atribuirlo a que cualquier individuo se encuentra sujeto a múltiples situaciones (infecciones intercurrentes, enfermedades autoinmunes propias de cada sujeto, etc.) que pueden modificar su respuesta inmunitaria, con independencia de que padezcan o hayan tenido alguna vez un tumor.

  • La inclusión de un número mayor de pacientes y controles sería la mejor solución para este problema.
  • En segundo lugar sería interesante realizar estudios longitudinales, determinando el patrón de citocinas producido por un mismo paciente en diferentes momentos.
  • Esto permitiría analizar mejor los cambios en patrones Th1/Th2 durante el curso de la enfermedad.

Por último, es importante estudiar si existe alguna modificación en el patrón de citocinas producido por un paciente cuando se encuentra en tratamiento con inmunoterapia, quimioterapia o con un régimen combinado. Los resultados realizados en la piel tumoral mediante la ténica de RT-PCR cuantitativa apoyan los datos obtenidos con la citometría de flujo.

Nos parece especialmente reseñable la diferencia que hemos hallado en la expresión de los transcritos de citocinas entre el nevus y los melanomas. Es además muy interesante el hallazgo de dos pacientes que mostraron un patrón Th0, pero todos los casos presentaron alguna de las citocinas características del patrón Th2 (IL-4, IL-5 o IL-10).

Además cinco de los seis melanomas tenían niveles de IL-10 superiores a los del control, reafirmando los datos encontrados en linfocitos T activados en sangre circulante. Nuestros planes son proseguir esta línea de investigación, profundizando en el estudio de la expresión de citocinas en el propio tejido tumoral, correlacionándolo con parámetros histológicos e inmunohistoquímicos que nos ayuden a comprender mejor la respuesta inmune frente a este tumor in situ.

  1. CONCLUSIONES
  2. 1) En sangre circulante existe un aumento en la producción de IL-10, citocina, con notable efecto inmunosupresor, en los pacientes con melanoma frente a los controles.
  3. 2) Observamos una tendencia en el porcentaje de células CD4 que producen IL-10, de manera que los controles son los que tienen menos células productoras de IL-10, los pacientes con melanoma metastásico tienen el porcentaje mayor y los pacientes con melanoma localizado se encuentran en un punto intermedio.

3) Esto explicaría el único dato estadísticamente significativo que hemos obtenido al comparar el grupo de pacientes con melanoma localizado y los metastásicos, que es el aumento en el número de lifocitos CD8 en estos últimos. Sin embargo, a pesar del aumento de los linfocitos CD8, los pacientes evolucionan hacia un estado de peor respuesta frente a su tumor, puesto que hemos comentado que la activación y proliferación de los linfocitos T en presencia de IL-10 puede conducir a un estado de anergia frente al tumor.4) En tejido tumoral se encuentra un patrón de expresión de citocinas Th2 o Th0 sin que exista correlación con el hecho de que el melanoma sea primario o metastásico.

¿Qué molécula caracterizan a los linfocitos T helper?

Linfocitos T – Los linfocitos T (células T) participan en la inmunidad mediada por células, en respuesta a los patógenos intracelulares (algunas bacterias, virus, parásitos), células tumorales y, en ocasiones, a implantes quirúrgicos. Las células T se originan de las mismas células madre hematopoyéticas pluripotentes que las células B y otros tipos de células sanguíneas, las cuales se encuentran principalmente en la médula ósea.

  1. Sin embargo, los precursores de las células T migran desde la médula ósea hacia el timo, donde se diferencian y maduran en células T funcionales, es de aquí de donde reciben su nombre.
  2. En el timo, las células T que se encuentran en proceso de maduración son sometidas a una extensa selección en la cual la mayor parte de las células T son destruidas tan pronto se desarrollan, y solo una fracción de ellas se alcanzan a madurar y migran hacia el torrente sanguíneo.

Esto es para garantizar que solo los linfocitos T maduros inmunocompetentes que sobrevivan puedan llevar a cabo sus funciones importantes, Los errores durante el proceso de selección de los linfocitos T son la base de las enfermedades autoinmunes, donde las células T destinan su respuesta inmune a las células y tejidos sanos del cuerpo; y de las inmunodeficiencias, lo que puede verse en el laboratorio como linfocitos bajos.

Células T citotóxicas: se caracterizan por presentar moléculas CD8+ en su superficie. Estas células son las principales en la respuesta inmunitaria mediada por células. Ellas reconocen y se unen a los antígenos presentados por las células infectadas por virus o células tumorales. Cuando la células T se une a la célula diana, la primera secreta linfocinas y perforinas que ocasionan la lisis de la célula diana. En algunos casos, los implantes quirúrgicos pueden ser blancos también, lo que resulta en el rechazo de injertos o trasplantes. Células T cooperadoras (T helper): se caracterizan por presentar moléculas CD4+ en su superficie. Estas células sirven para reconocer los antígenos extraños que se les presentan por medio de las células presentadoras de antígenos (como los macrófagos, células B y células dendríticas). Cuando una célula T cooperadora se une al antígeno presentado, esta se activa y comienza a producir citocinas que influyen en la actividad de las otras células inmunológicas, algo que en el laboratorio se apreciaría como linfocitos altos. Células T reguladoras (supresoras): también se caracterizan por presentar moléculas CD4+ en su superficie, pero ejecutan la función opuesta de las células T cooperadoras. Las células T reguladoras suprimen la respuesta inmunitaria al disminuir la actividad y diferenciación de las células T cooperadoras y de las células B.

¿Qué hacen los linfocitos CD4 y CD8?

¿De qué se trata esta prueba? – Este análisis sirve para medir la proporción entre 2 tipos importantes de glóbulos blancos que hay en la sangre. Los linfocitos son un tipo de glóbulo blanco del sistema inmunitario. En este análisis, se observan 2 de ellos, los CD4 y los CD8.

Los linfocitos CD4 encabezan la lucha contra las infecciones. Los linfocitos CD8 pueden destruir células cancerosas y otros invasores. Si tiene VIH, el recuento de linfocitos CD4 puede ser bajo. Sin un tratamiento contra el VIH, es probable que la cantidad de linfocitos CD4 que tiene continúe disminuyendo.

Por lo general, la ausencia de linfocitos CD4 provoca infecciones más frecuentes. Este análisis se usa para analizar la proporción de linfocitos CD4 y CD8. A través de esta proporción, el proveedor de atención médica sabe qué tan fuerte es el sistema inmunitario y puede predecir qué tan probable es que contraiga una infección.

¿Qué significa th2?

De Wikipedia, la enciclopedia libre Los linfocitos T H 2 ( T helper 2 ) son linfocitos T cooperadores o linfocitos T CD4 +, Se caracterizan por producir citocinas IL-4, IL-5 e IL-13,

¿Que baja los CD4?

¿Qué es un conteo de CD4? – Un conteo de CD4 es una prueba de sangre que mide la cantidad de linfocitos CD4 en la sangre. Los linfocitos CD4 son un tipo de glóbulo blanco. También se conocen como linfocitos T4 o “célula T auxiliar”. Esto es porque ayudan a combatir infecciones al hacer que el sistema inmunitario destruya virus, bacterias y otros gérmenes que pueden enfermarlo.

  • Un conteo de CD4 se usa más que nada para vigilar la salud del sistema inmunitario si está infectado con VIH (virus de inmunodeficiencia humana).
  • El VIH ataca y destruye los linfocitos CD4.
  • Sin tratamiento, el VIH puede destruir tantos linfocitos CD4 que el sistema inmunitario puede tener problemas combatiendo infecciones.

El VIH es el virus que causa sida (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). El sida es la etapa más seria de una infección por VIH. Si usted tiene sida, su conteo de CD4 es tan bajo que puede desarrollar infecciones serias de virus, bacterias y hongos que, en general, no causan problemas en personas sanas.

  1. Éstas son llamadas “infecciones oportunistas”, y pueden ser mortales.
  2. El sida también aumenta su riesgo de desarrollar ciertos tipos de cáncer.
  3. La mayoría de las personas con VIH no tienen sida.
  4. Y si toman sus medicinas para el VIH como se indica, puede que nunca desarrollen sida.
  5. Si usted tiene VIH, un conteo de CD4 puede ayudar a su profesional de la salud a revisar su riesgo de infecciones serias.

También puede utilizarse para ayudar a diagnosticar y vigilar otras afecciones que afectan el sistema inmunitario. Otros nombres: Recuento de linfocitos CD4, recuento de CD4+, recuento de T4, recuento de linfocitos T cooperadores, porcentaje de CD4, conteo de células T

¿Qué son los linfocitos Th y Tc?

¿Cómo se unen los linfocitos a los antígenos? – Al igual que antes, los linfocitos B y los T son diferentes. Mientras que los linfocitos B son capaces de detectar antígenos directamente, los linfocitos T son un poco más exquisitos y necesitan que sea otra célula la que les presente el antígeno procesado, Que Hacen Los Linfocitos T Helper

¿Cuáles son los linfocitos T reguladores?

Halima Moncrieffe, University College London, UK Traducción: Jesús Gil, Würzburg, DE (SEI) Como sugiere su nombre, las células T reguladoras (también llamadas Tregs ) son linfocitos T que regulan o suprimen a otras células del sistema inmunitario. Las células Treg controlan las respuestas inmunitarias de partículas extrañas o propias (los antígenos ) y ayudan a prevenir enfermedades autoinmunes. Dot plot de la expresión de CD25 y FoxP3 en células T CD4+ humanas por citometría de flujo. Las células Treg se caracterizan por la expresión del correceptor de célula T CD4 y la cadena a del receptor de IL-2, CD25, Por tanto, su fenotipo es CD4+CD25+. Las células Treg suprimen la activación, proliferación y producción de citocinas por parte de las células T CD4+ y T CD8+ y puede que también a los linfocitos B y células dendríticas. Las células Treg pueden producir mensajeros solubles con función inmunosupresora, lo que incluye TFG-β, IL-10 y adenosina.

A pesar de que el fenotipo CD4+CD25+FoxP3+ está bien aceptado, existen otros marcadores adicionales como CD152 (CTLA-4) y GITR (receptor de TNF inducido por glucocorticoides), aunque debe tenerse en cuenta que dichos marcadores son también expresados por otros tipos de células T de forma periódica (por ej.

células T activadas). En cualquier caso, no podrían ser utilizados como marcador diagnóstico inequívoco al estar expresadas en más poblaciones aparte de las Treg. Las células T que no tienen una capacidad de regulación especializada pueden sin embargo competir por recursos como los factores de crecimiento y estimulación por el MHC de clase II y, por lo tanto, pueden tener un papel “regulador” a través de este mecanismo general de competición.

¿Qué tipo de linfocito colaborador está involucrado en el asma?

Los linfocitos T colaboradores (LThCD4+) y sus productos de secreción tienen un papel central en la orquestación de la respuesta inflamatoria única en la vía respiratoria de asmáticos; los LTh2 específicos de antígeno generan esta respuesta mediante la secreción de citoquinas como IL-4, IL-13, IL-5 e IL-9.

¿Cuándo se activan los linfocitos Th1?

Las citoquinas intervienen en la activación y diferenciación de los linfocitos T y B, en la regulación del número de linfocitos necesarios en cada momento y en la duración de su vida media, incluyendo los linfocitos memoria. En definitiva, las citoquinas regulan las principales actividades de estas importantes células del sistema inmune. Esquema de la cooperación celular en la respuesta inmune adquirida. Las citoquinas juegan un papel muy importante en estos procesos. Como vimos en cooperación celular en la respuesta inmune, la activación de los linfocitos T y B tiene lugar mediante un complejo procesos en el que intervienen, además de ambos linfocitos, las células presentadoras de antígeno y el propio antígeno En este importante proceso, de la respuesta inmune adquirida, también intervienen las citoquinas, favoreciendo la activación de los linfocitos T y B.

  • Para que los linfocitos T se activen y entre en la fase G1 del ciclo celular, se requieren dos señales, una proveniente de la interacción con el antígeno y otra co-estimuladora.
  • Como consecuencia de esta estimulación se secretan la citocina IL 2, la cual permite la expansión y diferenciación de los linfocitos T en dos subtipos celulares de linfocitos T cooperadores CD4+ (T helper) los linfocitos Th 1 (T helper 1) y los linfocitos Th 2 (T helper 2).

Ambas poblaciones producen diferentes tipos de citoquinas. Los linfocitos Th 1, Están ligados fundamentalmente a la activación de los macrófagos en los procesos de eliminación de antígenos intracelulares, mediante la activación de la fagocitosis, o en los procesos de activación de las células NK, para inducir citotoxicidad en las células infectadas.

IL 2. Interleucina 2
TNF α β γ, Factor de Necrosis tumoral
IFN γ, Interferón.

Activación de los linfocitos B Los linfocitos Th 2, Están ligadas a la activación y diferenciación de los linfocitos B, Los linfocitos Th 2 reconocen el antígeno en la superficie de los linfocitos B, junto con las moléculas del SLA-II, e inducen la expansión clonal de las células B y la subsiguiente diferenciación a células plasmáticas productoras de anticuerpos,

IL 4 IL 5 IL6 IL10 IL 13

Además de los subtipos de linfocitos cooperadores Th 1 y Th 2 se ha descrito el linfocito cooperador Th 0 que parece estar ligado a un proceso intermedio de diferenciación entre Th1 y Th2. El Th 0 puede secretar citoquinas de ambos grupos celulares (Th 1 y Th 2).

PRINCIPALES CITOQUINAS RELACIONADAS EN LA RESPUESTA INMUNE ADQUIRIDA
CITOCINA ESTRUCTURA C. PRODUCTORA FUNCIÓN
IL 1 Monómero (18 kD) Macrófagos Elevación de la temperatura Activación de Linfocitos T y Macrófagos.
IL 6 Monómero (26 kD) Linfocitos Th2 Macrófagos Activación linfocitos T y B
IL 12 Heterodímero (75 kD) Macrófagos Neutrófilos C. Dendrítica Diferenciación de Linfocitos th1 Activación de células NK
IL 16 Homdímero (13 kD) Linfocitos T CD8 Inducción del receptor para IL2
TNF α Homotrímero (17 kD) Macrófagos Linfocitos Células NK Mastocitos Inflamación local Cambios de permeabilidad Elevación de Temperatura
IFN α Monómero (18 kD) Linfocitos Activación SLA I
IFN β Monómero (20 kD) Fibroblastos Activación NK
IFN γ Homodímero Linfocitos Células NK Inducción de SLA I y SLA II Presentación de antígenos.

Cómo se estudian las citoquinas? El estudio de las citoquinas presenta diferentes problemas. Unos ligados a sus propias características como su baja concentración, vida media corta y redundancia de sus efectos biológicos, lo que dificulta su estudio.

Métodos inmunológicos
Métodos moleculares.

Esquema de la producción de anticuerpos monoclonales Los métodos inmunológicos. La obtención de diferentes citoquinas recombinantes ha permitido producir anticuerpos monoclonales y desarrollar diversos métodos de valoración inmunológica para varias citoquinas. Imagen de un gel de PCR Los métodos moleculares se han podido desarrollar gracias al conocimiento de las diferentes secuencias de un gran número de citoquinas, que ha permitido la adaptación de técnicas de amplificación de PCR, permitiendo detectar distintas citoquinas en diferentes tejidos o células.

NUMERO DE CITOQUINAS CLONADAS
Especies humana y murina 36
Especie bobina 23
Especie ovina 20
Especie porcina 19
Especies felinas y equinas 11
Especies avicolas 7
Especie canina 5
Especies acuícolas 4 (peces)

En el caso del estudio de las citoquinas porcinas, a pesar de la importancia que esta especie tiene como modelo para la investigación en los trasplantes, como potencial para los xenotransplantes y como especie ganadera, todavía presenta varios problemas.

Por un lado, son muy pocas las citoquinas clonadas en esta especie, en comparación con otras y sobre todo el número de reactivos disponibles, para el estudio del funcionamiento y la regulación de las citoquinas porcinas, es muy escaso, La producción de citoquinas recombinantes es en la actualidad muy limitada y no se disponen en el ámbito comercial, lo cual limita la producción de anticuerpos monoclonales.

La mejor opción actual para el estudio de las citoquinas porcinas es la utilización de las técnicas moleculares de PCR cuantitativa.